Способ хроматографического определения летучих аминов и нитрозаминов

(З) 4 С 01 Я 30/ ОЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ КОГО ОПНИТРОЗ -ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ЭТНРЫТИЙ Н АВТОРСКОМУ С 8 ИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт питания АМН СССР (72) Я.Л.Костюковский и Д.Б.Меламед (53) 543.54 (088.8)(56) Костюковский Я.Л., Меламед Д,Б. Хроматофпуориметрические методы оп- . ределения микроколичеств органических веществ. - ЖАХ, 1982, т. 37, с. 713-718.Андерсон А.А. Жидкостная хроматография аминосоединений. Рига: Зинатне, 1984, с, 38-42.Костюковский Я.Л., Меламед Д.Б., Покровский А.А. Разделение и флуориметрическое определение И -нитрозаминов. - ЖАХ, 1978, т. 33, с. 808- 81 1.(54) СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕС РЕДЕЛЕНИЯ ЛЕТУЧИХ АМИНОВ И А МИНОВ,(57) Изобретение относится к способу хроматографического определения летучих аминов и нитрозаминов. Целью изобретения является упрощение идентифи.801259187 А 1 кации и повышение достоверности определения, С этой целью способ осуществляют следующим образом. Летучиеамины и нитрозамины экстрагируют изанализируемого образца, отгоняютрастворитель и обрабатывают остаток0,1 н.соляной кислотой, Обработанныйостаток делят на две или несколькоаликвотных частей, обрабатывают их,кроме одной, щелочью до рН 8-14. Затем упаривают досуха и растворяют.Полученные растворы наносят на хроматографическую пластинку, причемраствор необработанной части используют в качестве анализируемого. Растворы щелочных частей используют вкачестве стандартных после добавления к ним стандартных соединений.Анализируемый и стандартный растворы разделяют в системе растворителей и идентифицируют. Полученныепятна элюируют органическим растворителем, измеряют интенсивностьфлуоресценцин элюатов и проводятрасчет концентрации летучих аминови нитроэаминов. Способ позволяетоблегчить расшифровку хроматограмм.1 ил. 1 табл.1259187 3Изобретение относится к аналити- метиламина, аллиламина, диэтиламиначеской химии и может быть использова- ди-н-пропиламина и ди-н-бутиламинано для анализа микроколичеств лету- растворяют в 100 мл разбавленной сочих аминов и 4 -нитрозаминов в пище- ляной кислоты (0,1 мг/мл). Затемвых продуктах и других объектах окру 1,0 мл этого раствора смешивают сжающей среды. 9,0 мл той же кислоты, ПолученныйОпределению 9 -нитрозаминов и ами- таким образом раствор содержит понов в воде, воздухе, пищевых продук мкг/мп (0,2 мкг/мкл) каждого амитах и др, уделяется большое внимание йа.таккак Й -нитрозамины обладают вы О Все пробы растворяют в одинаковомраженным канцерогенным действием, а объеме органического растворителя,амины являются их предшественниками например 100 мкл бенэола, и хромаи способны нитрозироваться в объек- тографируют в системе растворителей,тах и в организме человека и живот- например, н-бутанол - уксусная кислоных. 5 та-вода. Пятна проявляют, например,При хранении пищевйх продуктов парами иода и путем сравнения окрапроисходит существенное повышение сок пятен опытной и стандартной пробконцентрации некторых аминов, что идентифицируют и оценивают содержаможет служить признаком их порчи. . ние аминовЦель изобретения - упрощение уо В случае определения нитрозамиидентификации и повышение достовер- нов их переводят в соответствующиености определения. вторичные амины; для этого экстрактНа чертеже представлена получен- упаривают до 0,5 мл и обрабатываютная хроматограмма, раствором бромисто водородной кислоСпособ осуществляется следующим 25 ты в уксусной кислоте (реакция деобразом. нитрозирования), Далее поступают какПробу пищевого продукта или объек- при определении аминов.таокружающей среды (например, сточ- Для количественрого определенияные воды) гомогенизируют с раствороманализируемые соединения переводятхлорида и карбоната натрия с целью ЗО в легко детектируемые производные,улучшения условий выделения и отго- окрашенные, фпуоресцирующие или погняют амины в 0,1 н, соляную кислоту, лощающие УФ-излучение. Для этогоВ случае извлечения Й-нитрозаминов все пробы обрабатывают раствором,образец гомогенизируют с сульфатом например, 1-диметиламинонафталиннатрия, а также сульфаниловой и сульфохпорида или 7-хлор-нитробен 35уксусной кислотами для предотвраще зо "2-окса" 1,3-диаэола. Полученныения образования нитрозаминов в про" три раствора экстрагируют органицессе перегонки. В дистилляте раст- ческим растворителем, например бенворяют едкий натр и карбонат натрия эолом, и экстракты наносят на хромадля связывания кислых примесей и тографическую пластинку. При этомэкстрагируют нитрозамнны эфиром. один из них явл%ется опытной пробой.Дистиллят, содержащий амины, упа", а два других - стандартными пробами,ривают досуха, растворяют в 2 мл содержащими различные количества0,1 н. соляной кислоты и делят на стандартных соединений, Пробы хромадве или более равных частей, напри- тографируют в системе, например,мер три. Две из них подщелачивают,45гексан-хлороформ-эфир 5: 5: 1, пласнапример, карбонатом натрия до рН тинку подсушивают на воздухе и иден 8- 14 (преимущественно до рН 9-11) тифицируют в УФ-свете анализируемыеи все части упариваются досуха, При соединения сраВнением пятен в опыт"этом из подщелоченных частей амины ной пробе с пятнами стандартных проб.улетают, К этим частям добавляют 5 О При этом можно оценить содержаниеразличные количества стандартов. аминов в объекте визуально, сравниСтандарты получают иэ химически чис- , вая интенсивность флуоресценции пятых аминов (как в случае анализа са- ,тен опытной и стандартных проб. Замих аминов, так и при анализе М- тем пятна элюируют органическимнитрозаминов), набор которых обуслов растворителем например бензолом,лен предполагаемой номенклатурой и измеряют интенсивность флуоресаминов или нитрозаминов в анализируе- ценции элюатов на флуориметре, исмом объекте. Например, по 20,0 мг ди- пользуя в качестве пробы сравнения259187 35 3стандартную пробу, наиболее близкуюк опытной по содержанию анализируемых веществ,Расчет концентрации аминов илинитрозаминов в объекте проводят по,Формуле НаКЧС = И ---- (мкг/л или мкг/кг), й, м где й - число проб, на которые 1 Оделят экстракт;йа, Н - интенсивность фпуоресценции элюатов опытнойи стандартной проб (относит.единицы).15Ч - объем добавленного раствора стандартов, мкл;масса, кг или объем, л,пробы, взятой для анали -за. 20П р и м е р 1. К 200 мп сточнойводы добавляют 70 г ИаС 1 и 1 О гИаСО и отгоняют 50 мл в приемник,в который предварительно заливают5 мп 0,1 н,НС 1, Дистиллят упариваютдо 2 мл и делят на две равные части. - Одну подщелачивают 5%-ным растворомИаСО в воде до рН 10, и обе части упаривают досуха. В подщелоченнуюпробу добавляют 5 мкл стандартногораствора, содержащего по 20 мкг/млдиметиламина, аллиламина, диэтиламина, ди-н-пропиламина и ди-н-бутиламина. К обеим частям добавляют по1,5 мл ацетонового раствора дансилхлорида ( мг/мл), доводят рН до8,5 и выдерживают 3 ч при 600 С. Затем добавляют по 1 мл воды и 0,5 мпбензола, тщательно перемешивают иотбирают бензольные слои. По 50 мкл каждой пробы хроматографируют на одной пластинке сульфола в системегексан-хлороформ-эфир 5;5:1 и рассматривают в Уф-свете с Я= 365 нм, Наличие фпуоресцирующих пятен с рав-.ными К в опытной и стандартной нро бах свидетельствуют о наличии соответствующего амина. Полученная хроматограмма изображена на чертеже.Для сравнения там же представленахроматограмма дансилированного раст- Овора чистых стандартов. Обозначенияна чертеже:- опытная проба, Ь -стандартная проба, с - раствор стан- . дартов; 1,2,3,4 и 5 - дансильныепроизводные аллиламина, диметилами-. 55на, диэтиламина, ди-и-пропиламина и ди-н-бутиламина соответственно. Пунктиром выделены эоны сравнения. 4Хромато граммы А, Ь и Г показывают, что легче идентифицироватьамины при сравнениии 6 , нежели4 и С , так как из-за наличия примесей, К веществ в Я изменяютсяпо отношению к К чистых стандартовв С , кроме того формы пятен в Я и оидентичны, чего нельзя сказать о Аи Г . При элюировании проб эонысравнения в А и б одинаковы, в А иочевидны различия. В пробе С стандарт элюируется с чистого силикагеля,в пробах 4 и 9 элюирование проводитсяс одинакового загрязненного Фона.Все это делает идентификацию и определение более достоверным при применении рекомендуемой стандартнойпробы.Пятна с одинаковыми К в опытной и стандартной пробах элюируютпо 1 мп бензола, центрифугируют иизмеряют интенсивность флуоресценции при 360/490 нм.Расчет, проведенный по Формуле,показал наличие аллиламина, диметиламина, диэтиламина, ди-н-пропиламина и ди-н-бутиламина в концентрациях6,0 мкг/л, 66 мкг/л, 33 мкг/л,4,8 мкг/л и 3,9 мкг/л соответственно.П р и м е р 2. К 200 мл сточнойводы добавляют 70 г ИаС 1 и 10 г ИадСОи отгоняют 50 мп в приемник, в который предварительно заливают 5 мл0,1 н. НС 1. Дистиллят упаривают до2 мл, делят на две равные части.Одну подщелачивают 5%-ным растворомИа СО до рН 11 и обе части упаривают досуха. К подщелоченной частипробы добавляют 100 мкл растворастандартов (как в примере 1), а кдругой части - 00 мкл разбавленной(0,1 мг/мп) НС 1, перемешивают и добавляют по 400 мкл смеси н-бутанол -уксусная кислота - вода 4:1:5 (пообъекту). По 100 мкл каждой пробыхроматографируют на одной пластинке ссиликагелем в системе н-бутанол -уксусная кислота - вода 4:1:5 (пообъему). Пластинку подсушивают навоздухе, выдерживают в парах иода1 мин и визуально, путем сравненияокрасок в опытной и стандартной пробе идентифицируют и оценивают содержание аминов, В анализируемойводе обнаружены диметиламин - около00 мкг/л и следы диэтиламина.П р и и е р 3. 100 г колбасы отдельной гомогенизируют с раствором80 г ИаБО, 1 г сульфаниловой кис1259187 5лоты и 10 мп уксусной кислоты в 200 мл воды, добавляют 5 мл 4 М НЕБО и отгоняют нитрозамины с водяным паром. Собирают 100 мп дистгллята, растворяют в нем 3 г БаОН и 20 г БаСО.и дважды экстрагируют 60 мл диэтилового эфира. Обьединенный экстракт сушат прокаленным НаВО и упаривают при 30 С до 0,5 мл; испаритель .промывают 1 мл уксусной 10 кислоты и добавляют к остатку. Туда же приливают 0,5 мл 37.-ной НВг в ледяной уксусной кислоте и полученную смесь делят на три равные части, которые нагревают при 100 С в течение 5 мин, Затем две части подщелачивают 5 Х-ным раствором ЮапСОз до рН 9 и все части упаривают досуха, К подщйлоченным частям добавляют: в одну - 2 а в другую - 4 мкл стан" дартного, раствора (пример 1). Кислую пробу подщелачивают до рН стандартных проб, добавляя 57-ный раствор НаСО. Во все пробы добавляют по 0,5 мп раствора НБД-хлорида (7- 25 хлор-нитробензо-окса,3-диаэол) в иэопропаноле (0,2 мг/мп) и выдерживают при 6%С в течение 1 ч. На одну пластинку силуфола наносят по 20 мкл каждой пробы и хроматографируют в системе хлороформ-бензол-этилацетатуксусная кислота 18:10:3:0,5. Затем пластинку подсушивают и сравнением окрасок пятен в опытной и стандартных пробах в видимом свете и интен 35 сивности флуоресценции в УФ-свете,с Л.365 нм пятен с соответствующими значениями К идентифицируют и оценивают содержание Ю -нитроэаминов в пробе. Дпя количественного определения пятна с одинаковыми значениями К снимают с пластинки, элюируют 1 мп бенэола, центрифугируют и измеряют интенсивность флуоресценции470/525,нм в сравнении со стандартом,45 наиболее близким по содержанию анализируемых веществ к опытной пробе, Расчет показал наличие нитрозодиметиламина и нитрозодиэтиламина в концентрациях 4 9 и 2 1 мкг/кг соответственФ50 но. Влияние рН на полноту удаления летучих аминов при упаривании растворов, содержащих различные амины, нанапример диэтиламин (ДЭА, Т 5555,9 фС) и ди-н-бутиламин (ДБА;Тел,=160 ф С) при исходных концентрациях 0,2 мг/мл отражено в таблице. Удалено при различных рНД2 8 9 11 14 ДЭА 0 99,3 100 100 100 ДБА 0 97,6 100 100 100 Из приведенных материалов видно, что подщелачивание раствора до рН вьппе 8 обеспечивает полное удаление летучих аминов. Введение значительного избытка щелочи нерационально, поэтому целесообразно подщелачивать раствор до рН 9-11.Надежная идентификация и определение по предлагаемому способу достигается при содержании 2-10 нг в пятне (по флуоресцирующим ф. производным).Способ проверен на различных видах воды и пищевых продуктов - мясных, рыбных и молочных.Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно облегчить расшифровку хроматограмм и облегчает идентификацию определяемых аминов и нитрозаминов. Вследствие своей простоты, быстроты и удобства выполнения способ может.найти применение как в научноисследовательских учреждениях, так и в лабораториях гигиенического (санэпидстанции и др.), экологического и производственного профиля для анализа летучих аминов и л -нитрозаминов в пищевых продуктах, кормах, воде, воздухе, почве, продуктах химической и резиновой промьпплеиности и дрНадежность и простота выполнения.позволяет рекомендовать этот метод для применения при анализе с помощью ТСХ, когда наличие примесных соединений затрудняет сравнение хроматограмм опытной пробы со стандартами. Формула изобретения Способ хроматографического определения летучих аминов и нитрозаминов путем экстракции их из анализируемого образца, отгонки растворителя, растворения остатка, нанесения1259 к аю лаз ф МУ Составитель В.Шк Техред А.Кравчук ва Т.Колб Редактор В.Да орре Тираж 778,НИИПИ Государствен по делам изобрет Москва, Ж-Э 5, Раув116 4 Зак Подпи омитета СССР открытий наб., д.4/5ого ний 130 твенно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул. Проектная,4 Произ полученного анализируемого и стандартных растворов на хроматографическую пластинку, разделения их в системе растворителей с последующей идентификацией и количественным анализом,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью упрощения идентификации иповыщения достоверности определения, остаток после отгонки растворителя обрабатывают 0,1 н. соляной 10 1878кислотой, делят на две или несколько аликцотных частей, обрабатывают их, кроме одной, щелочью до рН 8-14, упаривают досуха и растворяют с последующим использованием раствора необработанной части в качестве анализируемого, а растворов щелочных частей - в качестве стандартных после добавления к ним стандартных соединений.