Штамм бактерий bacillus sрнаеriсus-продуцент рестриктазы bsi 1

(51) 5 14, 1/2 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР)САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ОПИ В Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой штамм, который можно использовать для получения эндонуклеазИ рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 - СТС 6 И 6 - 3 в 3 - 6 А 6 САСв . составе двухцепочечной ДНК,Среди продуцентов рестриктаэ известен штамм 61 цсопоЬастег зцЬохубапз Н 15 Т - продуцент рестриктазы 6 зц 1. 6 зцоследовательность 5 .-СТ 66 А 6-3,подобно 3 -6 АССТСпоследо 1сти узнавания Вз 1 является часпалиндроМной и совпадает сей на 4/6. Однако рестриктаза 6 зцет заменить Вз 1 в силу различий ихательностей узнавания,стен штамм АпаЬаепа нагаЬ 1 з,рдеющий рестриктазу Ача 1, Ана 1 узледовательность 5 -СТСОА 6-3нако отличается от 3 -6(С)6 С 6 узнает п , котора вательн тич но последн не мож последо. Изв продуци нает пос торая од(21) 4909301/13 : (54) ШТАММ БАКТФИЙ ВАС 1 ШЗЯ (22) 07.02,91 ЯРНАЕЯ 1 СОЯ - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТА- (46) 30.12,92. Бюл, М 48 ЗЫ ВЯ 11(71) Научно-исследовательский конструктор- (57) Использование: биотехнология и генная ско-технологический институт биологически ак- инженерия. Сущность изобретения: штамм тивных веществ Научно-производственного выделен иэ пресйоводной" микрофлоры и объединения "Вектор" иЛимнологическийинс- хранится в ВКПМ ВНИИ генетики и селектитут СО АН СССР ции промышленных микроорганизмов под (72) В.С.Дедков, Н.И,Речкунова, С.Х.Дегтя- номером ВКПМ В, Штамм продуцирурев, П.А.Жилкин, А,А,Колыхалов и В.А.Вер- ет эндонуклеазу рестрикции Вз 1 1, которая хозина ., является нойым ферментом среди извест),)апцаЮз АВ 1 па 1 е 1.1 азКе 1 ечс 1 епе ных рестриктаз, Вз 1 расщепляет последо- В. А пеа зес)цепсе - зресйс епбопцс 1 еазе вательность 5 - СТСОМ 6 - 31 гов 61 цсопоЬастег зцЬохубапз, РЕВЯ 3-6 АОСАС -51 етсегз, 1983, 15, 243 - 247. в составедвухцепочечной ДНК, БиомассуВгцсе Я.А, зо 1 а 1 оп апб сйагастеглатопштаммавыращиваютприаэрацийвпитатель- оГ 1 по зес)цепсе - зрес 0 с епбопцс 1 еазеном бульоне на основе гидролизата кильки до 1 гогп АпаЬаепачаг 1 аЬ 1 з, Восмаев.,l., 1980, поздней логарифмической фазы. Клетки раз, 65-75, рушаютультразвуком й выделяют рестрикта 6 п 9 егаз Т,Я; е 1 а 1.А пею зресИс зу путем гель-фильтрации на биогелеА 0,5 М епбопцсеазе ргезем и Хамйогпопаз с последующей"хроматографйческой очисткассоа, Хап 1 погпопаз регачегсоа апд кой фермента на ДЭАЭ-целлюлозе и фосфоВгечЬастегцв цтецгп, - . Мо. Во 1. 1978, целлюлозе. Выход фермента 500 ед/г 118, 113 - 122 биомассы. Препарат пригоден для генно-инжейерных работ. 1 ил., 1 табл.последовательности узнавания рестриктазы Вз 11.Наиболее близким к изобретению поспецифичности продуцируемой рестриктазы является штамм Хапйовопаз Ьо 1 с 1 соа,продуцирующий рестриктазу Х 1 о 1, узнаюцую последовательность 5 -СТСОАО-З,13 -ОАОСТСкоторая однако на 1/6 отличается от последовательности узнаваниярестри"Ктазц- Вз 1-1, "Ч,аким образом;-К йастоящему временивсе известные рестриктазы отличаются попоследовательностям узнавания от рестриктазы Вз 1 1, Заявляемый штамм является продуцентом рестриктазы с неизвестнойранее специфичностью,Цель изобретения - получение штамма,продуцирующего рестриктазу, узнающую ирасщепляющую последовательность нуклеотидов 5 -СТСОТО Предлагаемый штамм выделен в результате поиска продуцентов рестриктаз изпресноводной микрофлоры,Штамм Вас 111 цз зрЬаег 1 сцз 2 Вдепонирован во 8 сесоюзной коллекции промышленныхмикроорганизмов ВНИИ генетики иселекции промышленных микроорганизмов(г. Москва) под номером ВКПМ В.Штамм ВасПцз зрйаегсцз 2 Вимеетследующие характеристики.Морфологические признаки. В молодойкультуре (1 6-18 ч) клетки подвижные, палочковидные, 0,6 мкм в поперечнике и 1,5-3мкм в длину. Располагаются поодиночке,иногда короткими цепочками, Грамположительные. Клетка способна образовыватьсферическую спору, расположенную терминально и раздувающую спорангий,Физиолого-биохимические признаки.Штамм - строгий аэроб. Каталазоположительный. Не образует кислоту, газ и ацетоиниз глюкозы. Кислоту не образует также изарабинозы, сорбита, рамнозы, сахарозы,. мальтозы, лактозы, глицерина, маннита,этанола. Гидролизует желатин, но не крахмал и твин, Не восстанавливает нитрат внитрит, Не образует сероводород и индол.В аэробных условиях растет на среде изгидролизата кильки при температуре от 4 до40 С (оптимум 37 С), концентрации йаС от0 до 3% (оптимум 0,7%), рН от 6 до 8 (оптимум рН 7), Содержание О+С в ДН К 41% (поплавучей плотности).Культуральные признаки, Среда 1, питательный агар, г/л; панкреатический гид ролизат кильки 17,9; ИаС 1 5,9; агар 11,2,рН 7,3+ 0,1, После 18 ч инкубирования при37 С образует крупные круглые приплюснутые гладкие блестящие сероватыеколонии.Среду используют для оживления культуры,Среда 2, питательный бульон, г/л; гидролизат кильки 33; ИаС 7, рН 7,3 + 0,1. Средуиспользуют для препаративного выращивания клеток, При встряхивании при 37 оС5 культура дает равномерную муть, сгустковне образует.Штамм Вас 1 Пцз зрЬаегсцз 2 В- продуцент рестриктазы Вз 1, узнающей и расщепляющей последовательность10 нуклеотидов 5 -СТСОТО3 -ОАОСАС в составе двухцепочечной ДНК, выделен иохарактеризован впервые.На чертеже изображена электрофорег;рамма разделения в 1%-ном агарозном геле15 продуктов расщепления ДНК фага Арестриктазами Ача 11+ исходная 1, ДНК (дорожка 1) и Вз 1 (дорожка 2). Длиныфрагментов маркерной ДНК даны в парахоснований.20 П г и м е р 1. Культивирование штаммаВас 1 цз зрЬаегсцз 2 Ви выделение рестриктазы Вз 11, Культуру высевают на среду1 в чашке Петри и инкубируют 17 ч при 37 С.Отдельную колонию переносят в 200 мл сре 25 ды 2 л г, выращиваюг при 37 С. Полученнуюкультуру используют для засева 4 л среды 2в ферментере фирмы 1.КВ (Швеция). Выращивание проводят при 30 С, с аэрацией 4л/мин, при скорости вращения мешалки 20030 об/мин. В конце логарифмической фазы роста (через 6 ч).клетки осаждают центрифугированием и хранят при - 20 С. Урожайклеток 4 г/л.Рестриктазу выделяют по традицион 35 ной схеме, включающей разрушение клетокультразвуком, гель-фильтрацию экстрактана биогеле А 0,5 М с последующей хроматографической очисткой фермента на ДЭАЭцеллюлозе и фосфоцеллюлозе. Препарат40 хранят в буфере с 50%-ным глицерином.Выход рестриктазы 500 ед/г биомассы.П р и м е р 2, Определение активностирестриктазы Вз 1. Фермент инкубируют 60мин при 37 С в 30 мкл реакционной смеси,45 содержащей 20 мМ трис-НС 1, рН 8,0; 20 мМйаС 1; 10 мМ МЫС 2; 2 мкг ДНК фага Л. Затемпроводят электрофорез смеси в геле 1%-нойагарозы. За единицу активности принимаютколичество фермента, достаточное для пол 50 ного специфического расщепления 1 мкгДНК фага А в этих условиях,П р и м е р 3. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Вз 1. Специфичность Вз 155 определяют сравнением экспериментальнополученными длин рестриктов ДНК фага Х стеоретически рассчитанными из первичнойструктуры ДНК, Длины фрагментов после гидролиза ДНК фага Л рестриктазой Вз 1определяют по электрофоретической подвижности относительно маркерных фрагментов (чертеж). При помощи ЭВМ рассчитывают длины фрагментов для всевозможных сайтов узнавания й сравнивают их с экспериментальными данными. Их совпадение (таблица) доказывает, что рестриктаза Вэузнает последовательность 5-СТСОТО3 -ОАОСАСв составе ДНК. Для подтверждения полученных данных проводят гидролиз ДНК плазмиды рВЯ 322 рестриктазой Вэ 1, Фермент расщепляет эту ДНК в положениях: 2655, 4030 и 43401 что также соответствует положенйю сайта 5 -СТСОТО3 -ОАОСАСв составе нуклеотидной последовательйости ДНК р 88322. Экспериментальные и теоретическиедлины фрагментов ДНК фага Л(в парах оснований) получены при расщеплении ДНК эндонуклеазой рестрикции Взи рассчитаны 5 для сайта 5 -СТСОТО3 -ОАОСАС.Таким образом, преимущество полученного штамма по сравнению с известными состоит в том, что для специфического рас.щепления ДНК по последовательности 5- 10 СТСОТО3 -ОАОСАСпригодна толькорестриктаза Вззаявляемого штамма. Формула изобретения Штамм бактерий Васоз зрйаегсакэ15 ВКПМ 8-5446 - продуцент рестриктазы 88 1.