Штамм бактерий bacillus меgатеriuм продуцент рестриктазы вме 361 i

(51) С 129/14, 1 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ го штамма Вас 111 ця тпе 8 агег 1 цтп ВКПМ В(361), синтдзируютпего рестриктазу Втпе 361 1 с повышенным выходом, Штамм вьщелен из почвы в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаз среди почвенных бактерий, нетребователен к питательным средам, не патогенен для человека, позволяет повысить выход рестриктазы Втпе 361 1, узнающей и расщепляюшей последовательность нуклеотидоя СВИСС, в 10 раз с 1 л культуры. Штамм обеспечивает повышенный выход рестриктазы, составляющей 100000 ед,/г биомассы. Для культивирования В. тперагег 1 цтп 36, применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды: пептон 10; дрожжевой экстракт 5, МаС 1 10. Культивирование проводят при температуре 30 С с хорошей аэраоцией в течение 24 ч. 1 табл.(54) ШТАММ КПМ - ПРО 361 1 (57) Изобр биологии и изобретени аракте кле алочнеподвижны, грамположительнь ковидные, соединены в длиннь в старой культуре возможны в неправильные Йормы, палочков клетки с веретенообразными к Размеры клеток 1,2-1,4 х 2,8-1 Споры не превышают диаметр к эллиптические, расположение р ное (центральное, эксцентрал терминальное),здутые нцами,,0 мкм.етки,знообразное,1оискасреди Культуральные и Йизиологическризнаки. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР А ВТОРСНОМУ СВИДЕТ(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) И,С,Андреева, Л.Р. Лебедев, Г.Д. Серов и Н М,Пустошилова (53) 577,15(088,8)(56) К 1 вв А., Ба 1 п В Сяогйая-готг Е, Чепегдапег Р., А петт веяцепсе - вресИ 1 с епт 1 опцс 1 еаяе (Вяр) 1 готп Васд 1- 1 цв вртаегт.сцв. - Сепе, 1977, ч. 1, р. 323-329.БАКТЕРИЙ ВАСП.1 ЛЯ МЕСАТЕДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗБ БМГ тение относится к микро генной инженерии. Целью является получение нов Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии, в.частности к получению рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов СГСС,Цель изобретения - получение нового штамма ВасПця тпе 8 аГегдцпт ВКПМВ(361), нетребовательного кпитательным средам и синтезирующегорестриктазу, способную узнавать ирасщеплять последовательность нуклеотидов СССС, .с высоким выходомШтамм Васд 11 цв тпе 8 аегцш 36вьщелен из почвы в, результате пштаммов-продуцентов рестриктазпочвенных бактерий,Штамм В. тпе 8 агегштп 361тся следующими признакамиМорйологические признаки40 Культивирование проводят при 30 Сос хорошей аэрацией в течение 24 ч. 45Выход биомассы составляет 10,0 гна 1 л среды. Выход рестриктазы составляет 1 млн.ед.акт, на 1 г биомассы.50Преимущества предлагаемого штамма Вас 111 цв шедаегцш 361 по сравнению с известным показаны в таблице.ФКак видно из таблицы В,шеяаегцш менее. требователен к составу питательной среды, выход биомассы этого штамма с 1 л среды как минимум в 5 раз больше, чем выход биомассы В,врйаел. - сцв. Выход рестриктазы с 1 л культуМетаболизм дыхательный. Реакциина каталазу, амилазу, желатиназу,фенилаланиндегидролазу и Фогес-Проскауэра положительны, Штамм восстанавливает нитраты, не выделяет индол,растет на среде с добавлением 7 Х ИаС 1,выделяет кислоту и газ на глюкозе,растет при рН 5,7, параспоральныетельца не обнаруживаются, наблюдаются неокрашенные глобулы, Максимальоная температура роста штамма 35-40 С,минимальная 3-20 С, рост при 50 Сотсутствует. Тест на лецитиназу, тиразиназу - отрицателен, при 0,001 Х 15лизоцима не растет.Штамм хранится в 15 Х-ном глицеринеов Ь-бульоне при минус 60 С и в лиофильно-высушенном состоянии,На РПА (рыбопитательный агар) образует непрозрачные, белесые колонии,,блестящие, со временем шероховатые,край ровный. На РПБ рыбопитательныйбульон образует .пленку, муть, осадок,Продуцируемая предлагаемым штаммом рестриктаза характеризуется следующими свойствами,Узнает и специфически расщепляетпоследовательность нуклеотидов ВЕССС;оптимальное значение рН дпя действиярестриктазы 75-9,0; оптимальная температура действия 37 оС; для активности рестриктазы требуются ионы М 8+Фс оптимальной концентрацией 5-10 мМ;оптимальная концентрация ИаС 1 0"50 мМ.Для культивирования В.ше 8 аСегхцш35361 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды;Пептон 10Дрожжев ойэкстракт 5БаС 1 10 ры В.шеяагегцш в 10 раз выше, чем с 1 л культуры В.враегсцвП р и м е р. Клетки В,шеаегдцш 36 1, хранящиеся в 15 Х-ном глицерине в Ь-бульоне при минус 60 оС, размораживают и высевают для оживления в Ь-бульон, инкубируют 24 ч при 30 оС. Полученную жидкую культуру высевают на чашки РПА для получения отдельных колоний, инкубируют 24 ч при 30 С, Выращенную на плотной среде культуру проверяют на чистоту и засевают ею 50 мл.Ь-бульона для получения инокулята, выращивают 18 ч при 30 С.о Полученным инокулятом (ОП З,б) засевают колбы с 250 мл ЬВ с 1 Х глюкозы, выращивают 24 ч (ОП 3,8), После охлаждения клетки собирают центрийугированием, Выход биомассы 10 г сырого веса с 1 л среды.0,5 г клеток суспендируют в 10 мл буфера 0,1 М трис-НС 1, рН 8,0, содержащего 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 Х тритон Х, 1 мг/мл лизоцима, в течение 20 мин при 0 С. Затем суспензию озвучивают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют . центрийугированием при 18000 об/мин в течение 40 мин при 4 С и надосадочную жидкость, содержащую 500000 ед, акт.рестриктазы, наносят на колонку (1 х 5 см) с Фосфоцеллюлозой Р 11 уравновешенной буфером .А (10 мМ калийфосйат, рН 7,4, 10 мМ 2-меркаптоэтанол). Затем колонку промывают 5 мл буфера А и сорбированные белки элюируют градиентом концентрации ИаС 1 от 0 до 1 М в буйере А, общий объем градиента 20 мп, Собирают Фракции объемом 1 мл. Фракции, содержащие активность рестриктазы (обычно элюирующиеся при 0,5-0,75 М ИаС 1), объединяют, диализуют в течение 3 ч против 200 мл буфера А. Отдиализованную Фракцию наносят на колонку (объемом 1 мл) с гидроксилапатитом, уравновешенным буфером А, промывают 2 мл буфера А, Сорбированные белки элюируют градиентом концентрации калиййосфата от 0,01 до 0,8 М. Общий объем градиента 10 мл, собирают Фракции по 0,5 мл, анализируют каждую Фракцию на содержание рестриктазы. Фракции, содержащие йермент, обычно элюиру 1 ощиеся при концентрации соли 0,4- 0,78 М, собирают и диализуют против буйера А, содержащего 50 Х-ный ггицерин. Полученный препарат фермента1080 Поскольку рестриктаза Вше 361 1имеет сайт узнавания СССС идентичныйсайту узнаваний ВврК 1 и Нае 111,она может заменить фермент и во всехгенноинженерных работах. Штамм бактерий ВасП 1 ов шеяаСегзлдп ВКПМ В- продуцент рестрик , тазыВше 361 1.(г/л) и рестриктазы (ед.акт,/л)состава питательной среды Состав, среды, г/л Выход ферментаед.акт./л культуры Выход биомассы, г/л среды В.шеяа- В.врЬаейегнш тсцв В.шеяа- В.врЬаег 3. -Сепляп сов Триптон "ЭИсо" Дрожжевой экстракт "ПИЬо" БаС 1Глюкоза 10 16720000 1192000 2,5 5 17,6 510 10 ПелтонДрожжевойавтолизатНаС 1Глюкоза 5 5 10,0 10 10000000 954000 2,0 Составитель И. ЧаплинаРедактор Л. Пчолинская Техред Л.СердюковаКорректор Ле Пилипенко Заказ 524 Тираж 362 . ПодписноеВНИНПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГЕНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат Патент"г.ужгород, ул. Гагарина,10 5 163 ,(1 мл) имеет концентрацию 500000 ед. акт./мл. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Я в течение 1 ч при 37 С. Ферментный препаратохранится при минус 20 С. Из 0,5 г получают 500000 ед.акт, рестриктазы Вше 361 1.Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Вше 361 1, проводят гидролиз ДНК фага ф рестриктазами Вше 361,1 ВврК, Нае 111 по отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазами. Полное совпадение фрагментов, полученных при гндролизе рестриктазами Вше 361 1 и ВврК 1, Нае 11 Т порознь и совместно указывает на то, что рестриктаза Вше 361 1 является изошизомером рестриктаз ВврК Т .и Нае 111, узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов СССС.1Зависимость выхода биомассыВ.шеяаегжш и В.врЬаетдсив от Полученный штамм обладает такжеследующими преимуществами по сравнению с известным: штамм не патогенен 5для человека не требователен к пиФтательным средам, хорошо растет,обеспечивая высокий выход культурыс 1 л среды, в 5 раз больший, чем известный штамм; обеспечивает повышен ный выход целевого продукта, составляющий 1000000 ед.акт,/мл биомассы