Способ конструирования плазмидной днк, штамм -продуцент эндонуклеазы рестрикции и способ получения эндонуклеазы рестрикции

(19)ЯОО 1 О СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 15/00 СУДАРСТВЕНКЫЙ КОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ АНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ т(21) 3330201/30-15 соответствующей плазмидной ДНК, о (22) 30.07.81 л и ч а ю щ и й с я тем, что, с (46) 07.02.85, Бюл Р 5целью получения рекомбинатной.плазмид- (72) А,А. Баев, А.Н, Кравец, .ной ДНК,РХВ. Ч 7, кодирующей эндонук- А.С. Солонин, Н.П. Кузьмин, А.Ф.Мороз, леазу рестрикции Е,соЕЧ, содержащей Л.И. Глатман и В.И. Таняшин . гены системы рестрикции и модифика- (71) Институт биохимии и физиологии ции Е,соКЧ, которые находятся под микроорганизмов АН СССР и Научно- контролем промотора фага % 1) , в каисследовательский институт эпидемио- , :честве плазмид используют плазмиды логии и микробиологии им,Н.Ф.Гамалеи , р 3 Ь 233 и р ЬС 1 13 и соединяют фраг- АМН СССР менты плазмид в условиях "торцовой (53) 575, 113:577. 15(088.8)сшивки",(56) 1. Солонин А.С, и др. Всесоюзный симпозиум "Макромолекулы клетки,2. Штамм ЕзсЬег 1 сЬа со 11 структура, функции, взаимодействия",ВКМВП (Всесоюзная коллекция Тезисы докладов, Москва, 1979, с. 31, микроорганизмов при Институте био 2. С 1 айтпап 1,. ес а 1, Ч 11 1 пегпа-химии и физиологии микроорганизмов Сопа 1 со 11 оц 1 цш оп 1 а 1)огаеогу ше 1 ода АН СССР) - продуцент эндонуклеазы )".ог ерЫеппо 1 оЕхса 1 зигче 111 апсе, рестрикции Е,соВ. Ч, С: р. 22, Иегпхцегос 1 е, 1 НЖ, МаЕ, 1981. 3. Способ получения зндонуклеазы (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПЛАЗМИД- . Рестрикции Е.соК 7,включающий выращи- НОЙ ДНК, ШТАММ ЕЯСНЕКТСН 1 А СОЫ-ПРО- ванне штамма - пРодуцента, РазРУшедуцЕНТ ЭНдоНУКЛЕАЗЫ рЕСТРИКцИИ) ния клеток, осаждение клеточных об- Е.СОК Ч И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКПЕ- ломков и последующую хроматографию юв АЗЫ РЕСТРИКЦИИ Е.СОВ. Ч полученного раствора, о т л и ч а ю- р "(57) 1. Способ конструирования плаз- щ и й с я тем, что, с целью увелимидной ДНК, включающий обработку чения выхода целевого продукта и по- двух плазмид эндонуклеазами рестрик- .вышения степени очистки в качестве ции, соединения фрагментов плазмид , .штамма - продуцента используют штамм с помощью ДНК-лигазы фага Т, транс- , Е.со 11 ВКМВвыращивание про формацию клеток ЕзсЬег 1 сМа со 11 водят до середины логирифмической смесью полученных фрагментов плазмид,. фазы роста, а после осаждения клеточ отбор среди .трансформантов, устой- . ных обломков проводят фракционироых к ампициллину клонов, обеспе-вание раствора фермента на фосфо- фающих рестрикцию и модификацию.целлюлозе с последующей хроматограа.с последующим,вьделением фией на гидроксилапатите. чив чив ",1 ВФ1040791 ред Т.Маточк 1 Щ Заказ 3111.1 4/5 Патен ужгород, ул фили ктная едактор О. Юркова Тираж 525 ВНИИПИ ГосударственногО коми по делам изобретений и от 3035,. Москва, Ж, РаушскаИзобретение относится к микробиологической промышленности и генетической инженерии,Фермент Г .со 8 7 используют вгенетической инженерии в экспериментах по конструированию рекомбинант 1ных ДНК.Известен способ констпуированиярекомбинантной плазмидной ДНК,который основан на клонировании фрагментов ДНК с полностью спаренными концами при помощи вектора Э 233,обеспечивающего прямую селекцию рекомбинантов.и сверхсинтез Ферментов Я .Известна плазмидная ДНК, кодирующая синтез эндонуклеазы рестрикцииЕ,со 11, известен соответствующийштамм Е. со 1 - продуцентгсок Ч испособ получения указанного фермента. 12 .20Способ получения фермента Е.со 1 Чвключает выращивание штамма - продуцента, разрушение клеток, осаждение клеточных обломков и последующую хроматографию полученного раствора фермента,Однако в известной плазмиднойДНК р 113 с размером 4,7 МЕ необнаружено дополнительных генети-,ческих маркеров. Уровень синтеза З 0.эндонуклеазы рестрикции Г. со Й Чотносительно невысок и равен - 50 хх 10 единиц на грамм сырого весабиомассы клеток.Целью изобретения является получение рекомбинантной плазмидной ДНК31,Я Ч 7, кодирующей эндонуклеазу.рестрикции Е.со. 11 Ч, содержащей генысистемы рестрикции и модификацйиЕ.соЧ, которые находятся.под контролем промотора Фага 1 ГЦель изобретения - получение штамма - продуцента 1.со к Ч , увеличе,ние .выхода целевого продукта (Фермен-та Е,С 08 Ч и повышение степени егоочистки).Для достижения цели в способеконструирования плазмидной ДНК, вклю-чающем обработку двух плазмид эндонуклеазами рестрикции, соединение 50фрагментов плазмид с помощью ДНК-лигазы фага Т, трансформацию клеток5.со 1 д смесью полученных фрагментовплаэмид, отбор среди трансформантов, устойчивых к ампициллину клонов,55обеспечивающих рестрикцию и модифика-,цко фагас последующим вьделением,соответствующей плазмидной ДНК в качестве плазмид используют плазмиды р 233 и р 1,С 13 и соединяют фрагт11 менты плаэмид в условиях торцовои сшивкиДля получения штамма - продуцента используют штамм ЕзсЬегсЬа со 1 д ВКМ ВР (Всесоюзная Коллекция Микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР) - продуцент эндонуклеазы рестрикции Е.сой Ч .Для достижения цели в способе получения эндонуклеазы рестрикции Г,со 3 Н, включающем выращивание штамма - продуцента, разрушение клеток, осаждение клеточных обломков и последующую хроматографию полученного раствора в качестве штамма - продуцента используют штамм б. со 1 х ВКМ ВР, выращивание проводят до середины логарифмической фазы роста, а после осаждения клеточных обломков проводят фракционирование раствора фермента на фосфоцеллюлозе с последующей хроматографией на гидросилапатите.П р и м е р 1. Рекомбинатная плазмидная ДНК ь 1.Я ЧГ с размером 7 т.п.о.)(схема плазмидной ДНК 31,Ц 7 представлена на фиг. 1) содержит гены системы рестрикции и модификации Е сой Ч, которые находятся под контролем промотора Фага лямбда 91 и состоит изВЕ 1 11-Р.ц 11-фрагмента ДНК у 31.КЧ 7, содержащего сайты рестрикции ВЕ 1 11,1.сой 1, Р 1, расстояние между которыми 0,4; 0,7 и 1,5 т.по. (фиг. 1, табл. 1).11-В 1 11-фрагмента ДНК плазИмиды р 1 Ц 13, содержащего сайты рестрикции Руц 11 91, Вя 1 11, расстояйие между которыми соответственно равно 1,4; 1,3 т.п.о. (Фиг. 1, табл. 1);Вя 1 11-фрагмента, состоящего из ВЕ 1 11-Нра 1 Фрагмента ДНК рЗЬ 233 с пРомотоРом Рь и ВЦ 1 11 - Рчц 11 ФРагмента ДНК плазмиды р 1 С, 13 (фиг,1,табл, 1)Ь 1 а-ген, ответственный за синтез й-лактамазы, гены системы рестрикции и модификации Г,со 3 Ч , и репликом плаэ миды рЬ 11 322.Сущность способа конструирования указанной плазмиды состоит в том, что ДНК плазмиды 3233 одновременно расщепляют эндонуклеазами3 1040 рестрикции Нра 1 и Рщ 11, смешивают с Р 11 фрагментами р Д 13 и соедиМОняют ДНК-лигазой фага Тв условиях торцовой "сшивки". Полученной смесью трансформируют клетки Р.со 11 и отбирают клоны на селективной агаризованной среде с ампициллином, среди полученных трансформантов по устойчивости к ампициллину отбирают клоны, обеспечивающие рестрикцию и модифи кацию фага., из полученных клонов выделяют искомые рекомбинатные плазмиды.Штамм - продуцент эндонуклеазы рестрикции ь.,соц, полученный транс формацией плазмиды ЭЬК М 7 в штамм .со 11 3 С 5183, обеспечивает синтез эндонуклеазы рестрикции Е со О в количестве не менее 2 х 10 единицЬ на грамм сырого веса клеток. Штамм 20 Езспег 1 сп 1 а со 11 3 С 5183, содержащий плазмиду 3 1 М 7, депонирован в Всесоюзной Коллекции Микроорганиз. мов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМ ВЛ. 25Штамм Е.со 11 ЗС 5183, содержащийплазмиду31.ц 1 7, характеризуетсяследующими признаками.1Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы,1,2 - 1,6 х 2,0 х 6,0 мкм, подвижные, с перитрихиальными жгутиками,грамм-отрицательные, неспороносные.Культуральные признаки. Хорошо 35растут на простых питательных средах. При росте на.мясо-пептонномагаре, питательном агаре "Дифко"колонии гладкие, круглые, прижаты,блестящие, серые, край ровный, мутные. При росте в жидких средах: мясопептонном бульоне, б -бульонеобразуют ровную интенсивную муть,физиолого-биохимические признаки. Растут в пределах от 4 до 45 С 450при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности-глюкозу, К -фруктозу, галактоэу, арабинозу, лактоэу, трегалозу. Не .усваивают ацетат, аданит. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической фор- уме в виде пептона, аминокислот. Нит-:раты восстанавливают до нитритов.Желатину не разживают, Уреазная активч ность не обнаруживается. Индол необразуют.Устойчивость к актибиотикам.Проявляют устойчивость к ампициллину.Предлагаемый способ получения специфической эндонуклеазы Е, со ц 1 включает в себя выращивание биомассы клеток штамма-продуцента, содержащегоплазмиду рЗЯ / 7, в жидкой питательной среде до середины логарифмической стадии роста, разрушение клетокультразвуком, осаждение клеточныхобломков центрифугированием, фракционирование на фосфоцеллюлозе, используя :тупенчатое повышение ионной силы буферного раствора с последующей очисткой активных фракций фермента на гидроксилапатите,П р и м е р 2. При конструиро -вании рекомбинатной плазмиды р 11 Р 7донором служила ДНК плазмидыС 13,а реципиентом - ДНК плазмиды р 31, 233.Для выделения плазмидной ДНК1,С,13 штамм 3 С 5183, содержащий плазмиду, подращивают до титра 5 10 кл/мгв 1,2 л среды В (Среда 1.В содержит10 г бактотриптона, 5 г дрожжевогоэкстракта и 10 г МаС 1, рН 7,4 нал воды) .1Клетки осаждают центрифугирова-.нием при 6000 я, 4 С и ресуспендируют в 40 мп 25%-ной сахарозы в 0,05 М трис-НС 1 буфере, рН 8,0. Лизис проводят при 0 С. Для этого к суспензиидобавляют 4 мл раствора лизоцима (5 мг/мп), через 10 мин - 16 мл раствора ЗДТА, рН 8,0 и через 5 мин, осторожно перемешивая, смесь 5 М раст. вора ИаС 1 до конечной концентрации 1 И с 10%-ного раствора додецилсульфата натрия до конечной концентрации 1%-ной. Полученный таким образомлизат инкубируют при +4 С 12 ч. Лизат осветляют" центрифугированием при 22500 я (+2 С, 60 мин). ДНК концентрируют добавлением 50%-ного раствора полиэтиленгликоля 6000 до конечной концентрации 10%-ной и 5 М раствора цо конечной концентрации 0,5 М, смесь выдерживают 6 ч при +4 С. Образовавшийся осадок собираютцентрифугированием при 2000 я, 4 С(5 мин) и ресуспендируют при 4 С в16 мл ТЭН-буфера (30 мМ трис-НС 1,рН 8,0, 2,5 мИ ЗДТА, 50 мИ ИаС 1) .Препарат экстрагируют один раз хлороформом, фазы разделяют центрифугированием при 9000 я, 4 С, 10 мин.20 Верхнюю фазу, содержащую ДНК, диализуют в течение 16 ч против ТЭН-буфера, при трехкратной смене буфера(+4 С). К раствору добавляют бромидэтидия до конечной концентрации300 мкг/мп и СзС 1 плотности 1,3925,после чего препарат центрифугируютпри 96000 я 40 ч (+15 С) . Отбираютзону содержащую плазмидную ДНК,У10шприцем, проколом пробирки сбоку.Полученный препарат экстрагируют изоамиловым спиртом до полного удаления этидия, после чего диализуют при+4 С против ТЭ-буфера. Затем ДНКэкстрагируют фенолом, насыщенным1550 мМ трис-НС 1, рН 8,0От фенолаизбавляются экстракцией равнымиобъемами эфира 5 раз. На завершающем этапе ДНК концентрируют добавлением трех объемов охлажденного96%-ного этанола при -20 С, После6 ч при -20 С осадок собирают центрифугированием при 6000 (-10 С,15 мин.), высушивают в 500 мклТЭ-буфера.25Для выделения плазмидной ДНК233 клетки с плазмидой выращивают в 500 мл бульона 1,В , Клеткисобирают центрифугированием при6000 я 15 мин +4 С. Осадок суспен- ЗОдируют в 4 мл 25%-ной сахарозы в50 мМ трис-НС 1 рН 8,0. Начиная с. этого этапа, все последующие операции проводят на холоду (ОС). Ксуспенэии клеток добавляют 1,2 мллизоцима (5 мг/мл), через 10 минв инкубационную смесь вносят 2,6 мл0,25 М ЭДТА, рН 8,0, Полученныйлизат центрифугируют 1 ч при 48000 я,+3 С. К супернатанту добавляют бро. - 40мид этидия до конечной концентрации300 мкг/мл. СзС 1 до плотности1,3925 и центрифугируют при 9600040 ч. +15 С. Отбирают зону, содержащую плазмидную ДНК шприцем, проколом пробирки сбоку. Бромид этидияудаляют экстракцией изоамиловымспиртом. Раствор ДНК диализуют 24 чпротив ТЭ буфера при четырех сменахбуФера, 50Полученные препараты ДНК плазмиды16 13 и 3 233 используют для конструирования рекомбинантной )1,У 7.ДНК рЬ 13 (3 мкг) инкубируют с эндо-нуклеазой рестрикции Р 11 в буфере 55А: 20 мМ трис-НС 1 рН 7,6, 10 мМ дитиоэритритола, а ДНК 3 Ь 233 (1 мкг)с эндонуклеаэой рестрикции Нра 1 и 11 - в буфере В: 50 мИ трис-НС 1,1 рй 7,6, 50 мМ КС 1, 10 мИ ИяС 1, . Гидролиз проводят 1 ч при 37 С, послечего гидролизаторы прогревают до65 С 10 мин. Полноту гидролиза нро-веряют электрофорезом в 0,9%-номагарозе в ацетатном буфере. В дальнейшем ДНК р 5 13 (2 мкг) смешиваютс ДНК р 1 233 (0,2 мкг) и осаждаюттремя объемами 96%-ного этанола(-20 С, 4 ч) . Осадок собирают центрифугированием при 10 000 8, 4 мин,высушивают и растворяют в 5 мкл буфера С: 50 мМ трис-НС 1, рН 7,4, 50 мМ,10 мИ Мя. Добавляют дитиоэритритол иАТФ до конечной концентрации 10 мМи 100 мкИ соответственно и 5 мкл лигазы для торцовой ошивки. Общийобъем лигируемой смеси - 12 мкл. Лигирование проводят при комнатнойтемпературе (18-22 С), 36 ч, Черездвенадцатичасовые интервалы отбираюталиквоту. (2 мкл), разводят до 50 мклдистиллированной водой и трансформируют Са+ -клетки Е, со 11.Получение компетентных клеток итрансформацию проводят по СовдепЯ.Б., А.С.Ч.СНапд (1972. РНАЯ, БВА,69: 2110-2114) .Трансконъюганты высевают на селек-,тивную среду с ампициллином,(30 мкг/мп). Выросшие клоны тестируютна наличие плазмидной ДНК с ожидаемыммолекулярным весом (5 И 0) методомТ.Ес. 1 ссЬаго (1978, Р 1 азшЫ, 1,548-558).Для анализа Физической структурыплазмидную ДНК выделяют ускореннымметодом (К 1 е 1 п Р,1 ейа 1, 1980,Р 1 азтпЫ, 8, 88-93) .Рестрикционный анализ проводят спомощью эндонуклеаз Р-1, Вя 1 11,11, Отобранные. клоны проверяютна присутствие системы рестрикциимодификации Есо 87. Для этого сравнивают эффективность посева (э.п.)фага; 0 на клетках, содержащихрекомбинантные плазмиды, а такжештаммах С 5183 (гь. -где ) и ) С 5183( г т+ ) с плазмидой рЬ 13. Наличие в клетках модификации устанавливают при снижении э.п. методом(Т. Ага, А.Ао 1 с 1, 3.Васй. 5, 18,1962) . Полученные данные представлены в табл. 2,Как видно из табл. 2, штамм3 С 5183/С 113 на четыре порядка ограничивает размножение фага Ъ0по сравнению со штаммом 1 С 5183( ГО ), не несущем плазмидуу 13. Наиболее высоким уровнем ограничения обладает штамм С 5183//р 3 Ь й Ч (в 5 раз более высоким по 5сравнению со штаммомС 5183/5 С, 13) .Фаги, выращенные на клонах с реком.бинантными плазмидами, дают одинаковый титр на штаммах ЗС 5183 и 3 С 5183//.Юз.0Таким образом, рекомбинантнаяплазмида р 3Ч 7 содержит генысистемы рестрикции-модификацииЕсо, ген беталактамазы, определяющей резистентность к ампициллину, 5а также,как показано на фиг. 1,мощный промотор фага ЪЬ . Плазмар).КЧ 7 состоит из Нра 1- -11 фрагмента плазмиды рай, 233 с размером2300 пар оснований и 0 ч -11 фрагмента плазмиды 1,С, 13 с размером в3700 пар оснований. Общий размерплазмиды - 7 000 пар оснований, ВДНК плазмиды3 ,Ч 7 имеется двасайта эидонуклеазы 1 1, два сайта 25эндонуклеазы В р 1 11 й по одномусайту эндонуклеаз Рц 11 и Е,со1.Расстояние между сайтами даны втабл. 1. Фаговый промотор , расположен на В 81 11-В 81 11 фрагменте З 0плаэмиды рЬКЧ 7 и удален на 300 пароснований от начала фрагмента Ч 11плазмиды р 3 13. Следовательно, фаговый промотсрмаксимально прибЬлижен к генам системы рестрикциимодификации Е.со Ч и обеспечиваютих .активность. Релликация плазмидырЭ. Ч 7 осуществляется за счет репликона плазмиды р И 322.П р и м е р 3. Для получения , 40штамм-продуцента эндонуклеаэы рест-.рикции :,со Ч рекомбинатную плазмидную ДНК ДЧтрансформируют вштамм Е. со 11 3 С 5183. Фенотип штам-ма 3 С 5183-ЕхоЧ Егсо 1-Ехо 7 111 45(" Молекулярная биология", т. 1, ч, 11с. 77, 1980), что позволяет его ис-пользовать в качестве хозяина, обладающего минимальным уровнем примес-ных ферментативных активностей.ИКлетки штамма 3 С 5183 подращивают до титра 2-3 10 мкл/мл,после .8чего осаждают при 6000 8 15 мин,0 С. Клетки суспендируют в равномобъеме О, 1 М хлористого кальция и увьдерживают при 0 С 1 ч, после чего повторно осаждают при 6000 8,0 С и ресуспендируют в 1 мл О, 1 М хлористого кальция. В 50 мкл ДНК, полученной после лигазной обработки, добавляют О мкл компетентных клеток. Смесь вьдерживают 20 мин при ОС, затем 2 мин при 42 С и 10 мин при комнатной температуре, добавляют 1,3 мл среды . 8 , ийкубируют 2 ч при 37 С с аэрацией. Суспенэию высевают на чашки с ампициллином 30 мкг/мл) . Трансформанты отбирают по методу, описанному в примереСконструированный штамм Е.со 1 ДС 5183 с плазмидой р ).М Ч 7 и .штамм Е, со 1 д 3 С 5183 с плазмидой у0 13 проверяют на продукцию рест- риктазы Е,со Ч. Для этого обе культуры подращивают в 1 л среды . В до титра 5 х 10 клеток 1 мл. КлеткиВосаждают центрифугированием при 6000 я 15 мин, после чего по 0,9 г сырого веса биомассы каждого штамма суспендируют в 6 мл буфера 50 мМ трис-НС 1, рН 7,6, 0,2 М БаС 1 3 мМ -, меркаптоэтанола 100 мкг/мл лизоцима и выдерживают 40 мин при 0 С. Клетки разрушают ультразвуком. Полученный экстракт центрифугируют при 48000 д 2 С ч. Супернатант используют для определения активности фермента С этой целью делают серийные разведения экстракта: 1/100, 1/500, 1/1000, 1/25.000, 1/50000 см.фиг.2). По 1 мкл на каждого разведенияинкубируют 1 ч при 37 С с 1 мкгДНК фагав 30 мкл инкубационнойсмеси с 50 мМ трис-НС 1 рН ,6,50 мМ ИаС 1, 10 мМ МС 1 6 мИ й-меркаптоэтанолом. Электрофореграмма продуктов гидролиза представлена нафиг. 2. Как видно, уровень активности фермента эндонуклеазы рестрикцииЕ.со Ч в бесклеточном экстрактесконструированного штамма Е. со 11ВКМ Вболее чем в 5 раэ вышеуровня активности этого же ферментав штамме Е. со 11: С 5183/р,С 13 исоставляет в пересчете на 1 г сыроговеса биомассы около 3 000 000 едактивности фермента Е.со 8 Ч,П р и м е р 4. Вьщеление специфической эндонуклеазы рестрикции с.со 1,Клетки Е. со 1 ь. 3 С 5183, содержащие рекомбинантную плазмиду 3 1, ВЧ, выращивают при 37 С, с обильной аэрацией до середины логарифмической стадии роста в среде ЬЬ . Выход биомассы составляет около 2 ч на литр среды.Биомассу клеток штамма-продуцента собирают центрифугированием прн 6000 я 30 мин, Полученную биомассу клеток хранят при -20 С.10 граммов (по сырому весу биомас сы клеток суспендируют в 50 мл буферного раствора А: 50 мМ калий-Фасфатного буфера, рН 7,0 1 мМ ЭДТА, 1 мИ БаИ 7 мМ В-меркаптоэтаыола, содержащего 400 мМ БаСТ,добавляютлизоцим до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубируют (ОС) 15 мин.Полученные после обработки бактериальных клеток лизоцимом сферопласты разрушают ультразвуком на дезинтегра - 15 торе типа "М Е" 30 с х 20 раз с интервалом в 90 сПри разрушении тем-. пература суспензии не должна превышать +8 С. Клеточный дебрис убирают центрифугированием при 75000,в тече в 20 ние 90 мин +4 С. В полученном экстакте определяют активность фермента Е.со Й У в разведении 1: 10, 1: 100, 1:500 и 1; 100. 1: 10000 (разводят буферным раствором А до конечной концентрации ИаС 1 200 мМ).Разведенный экстракт наносят наколонку с фосфоцеллюлозой (2 х 25 см,"Жастпап" Р 11), уравновешенную буфером А, содержащем 200 мИ ИаС 1.Колонну с Фосфоцеллюлозой посленанесения экстракта клеток промывают 2-3 объемами колонки буфернымраствором А, содержащим 200 мИ БаС 1и фермент элюируют тремя порциями 35буфера А, содержащего 400 мМ,600 мМ и 800 мМ ЫаСТ. Активные Фракции фермента элюируются в 1/3 объемаФракции 400 мИ ИаС 1 и 2/3 объемафракции 600 мМ НаС 1, Активность Фермента Г.соМ определяется в разведениях элюата в 1:10, 1:100 и 1:500раз. Активные фракции ФерментаБ.соР 7 объединяют вместе и разводятхолодным (+4 С буферным раствором А 45без ИаС 1 в два раза, и наносят наколонку (2 х 5 см) с гидроксиланати-том и элюируют Фермент 200 мл линейного градиента концентрации калийфосфатного буфера рН 7,0 от 50 до 50500 мИ (см. Фиг. 3). Активность Фермента с.со 81 определяют во фракцияхв разведении 1:10, 1:100, 1:200,.1:500. 20 мп элюата с гидроксилапати"та, обеспечивающие полный гидролиз 551 мкг ДНК фагав разведении 1:200,диализованные при двухкратной сменечерез 4 ч против буферного раствора Ь, содержащего 10 мМ калий-Фосфатного буфера рН 7,0, 1 мМ ЭДТА,1 шМ Бай 2 мМ В-меркаптоэтанолаокончательно концентрируют диализомпротив буферного раствора Ь, содержащего 503 (об/об) глицерина.После концентрирования ферментапри диализе против 507-ного глицерина, объем раствора фермента Б .со 1составил 4.,8 мл с удельной активностью 1, 2 х 10 ед/мл (3 000 000 ед/мгбелка). Это составляет 6 000 000 едили 20 Е от суммарной активности внеочищенном экстракте (см. табл. 3).За единицу активности специфической эндонуклеазы Г,со КМ принимают минимальное количество фермента, необходимого для полного расщепления 1 мкг ДНК фага % в течениеч при 37 С.Полученный Фермент Г.со 1 1 разводят буферным раствором, содержащим10 мМ трис-НС 1, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА,1 мМ МаИ, 10 мМ ДТТ, 200 мкг/млжелатина и 507 (об/об) глицерина в100, 500 и 1000 раз и определяютактивность.Для этого к 3 пробам объемомпо 30 мкл, содержащим 1 мкг ДНКФагаС 852, 50 мМ трис-НС 1, рН7,5, 50 мМ ИаС 1 и 10 мМ ИяС 1 , добавляют 1 мкл разведенного в 100,500 и 1000 раз Фермента соответственно, инкубируют 1 ч при 37 С и 5 минпри 65 С и охлаждают в ледяной бане.Полученные таким образом пробы анализируют электрофорезом в пластинчатом 0,87.-ном агарозном геле (90 мМтрис-боратный буфер, рН 8,3).Пригодность полученного ферментадля структурных иссхйдований ДНК иопытов по конструированию ьп чьегорекомбинантных молекул ДНК определяют следующим образом:а) инкубируют ДНК плазмиды р."П, 233,не содержащей сайта расщепления эндо-нуклеазы Е,со 11, с 10-кратным избытком фермента в течение 2 ч, при последующем анализе электрофорезом не наблюдают перехода ковалентнозависимойсуперскрученной формы плазмиднойДНК в релаксированную и линейнуюФормы, что указывает на отсутствиепримесей неспецифических эндонуклеазв препарате фермента;б) пригодность препарата фермента Г.со 1 для генно-инженерных работ определяют по способности вос -соединения Е. со Вфрагментов ДНК бактериофага лямбда с. помощью ДНК-лигазы бактериофага Тс последующим электрофоретическим анализом продуктов реакции (см. фиг. 4),. 5Таким образом, предлагаемые объекты позволяют получать высокоочищенный препарат эндонуклеазы рестрикции с. со 1 , с выс оким выходом.Предлагаемые изобретения позво ляют получить штамм Е.со 1 д продуцент эндонуклеазы рестрикции Б.соВ 1 .Уровень содержания фермента в предлагаемом штамме Е . со 11. ВКМ В 1450 З не менее 3 х 10 единиц на 1 г сырого -15 веса биомассы клеток, что в пять раз превосходит по уровню синтеза исходной штамм 3 С 5183/13. Данные для сравнения приведены на фиг. 2.: Рекомбинантная плазмида р 3 К 1 7 20 содержит маркер резистентности клеток к ампициллину, что дает возможность стабильного культивирования клеток с рекомбинантной плазмидой.Схема очистки активного фермента 25 эндонуклеазы с. со11. НЕОЧИЦЕННЫЙ ЭКСТРАКТП. Фракционирование на фосфоцеллюлозе Р 11 ЗО(0,4 М, 0,6 М, 0,8 М ИаС 1)Точки элюции фермента0,4 и 0,6 М ИаС 1Й. Хроматография на ГАП (0,05 М0,5 МК -фосфатного буфера рН 7,0Точка элюции фермента 0,23 М К+ фосфатного бу фера1 У. Концентрирование фермента (диализ против 507 глицеринаПризнак является особенно существенным при подготовке посевного 45 материала для засева больших объемов в условиях промышленного производства фермента, так как позволяет созранить популяцию клеток с системой модификации и рестрикции ,со Р50Кроме того, наличие в плазмиде маркера резистентности к ампициллину открывает перспективы дальнейшего конструирования различных штаммов: 55 Е.со 11 с увеличенным синтезом конечного продукта и с пониженным содержанием интерферирующнх ферментов. Предлагаемый способ конструирования рек омби нант ной пл а эмид ной ДНКобеспечивает высокое содержаниеплазмиды в клетках за счет многокопийности вектора и приближенность мощного фагового промотора и генам,кодирующим синтез,рестриктазы иметилазы Г.со В 7, что в сумме увеличивает дозу гена и повышает эффективность транскрипции,В отличие от известных способовконструирования в предлагаемом изобретении в качестве вектора использовалась плазмида РЛ. 233, котораяпозволяет прямую селекцию клонов срекомбинантными плазмидами при интеграции чужеродных фрагментов с полностью спаренными концами. Применение данной системы клонирования обеспечивает введение чужеродных геновпод контроль мощного промотора фагаЪбез дополнительного синтеза исскуственных "липкихконцов, которые могут нарушать транскрипцию награнице вектор-чужеродный фрагмент.Штамм Р.со 1 ь ВКМ Вкак продуцент специфической эндонуклеазыЕ.со обладает следующими преимуществами:а) повышенный синтез конечногопродукта;б) пониженное содержание неспецифических нуклеаз (например. соО)что позволяет существенно упроститьспособ очистки фермента;в) отсутствие ауксотрофных митаций позволяет получать биомассуклеток на синтетических средах врезистентностью к ампициллину иобеспечивает стабильное культивирование штамма-продуцента. Перечисленные свойства данного штамма позволяют его использовать в качестве продуцента как в лабораторных условиях,так и на промышленных установках,что особенно важно в связи с отсутствием этого фермента и его изошизо меров в коммерческих каталогах иэостранных . фирм.Предлагаемый способ выделения ,специфической эндонуклеазы рестрикции Е.со Ц 1 позволяет сократить время получения фермента в 2-3 раза и увеличить выход конечного продукта в 10 000 раз по сравнению с базовым 1 объектом. Полученный таким образом препарат эндонуклеазы 1. со Й.1 не .содержит интерферирующих активностей,1040791 14Полученный таким способом препаратфермента специфическая эндонуклеаэа рестрикции Е .со 11 превосходит лучшие образцы зарубежных коммерческих5 препаратов (например, Фирмы "Бэрингер" фРГ и "ВЫ." США) - Ферментов данного класса по удельной активности и соответствует им по степени очистки,13.Таблица 1 Ве 1 11-ЕсоК 1 Есо1- Р 1 р1-РУЧ 11 Р 11-Р, Рз 1-Вя 1 11 0.7 1,4 1,3 В 81 11-В 81 11 1,7 Таблица 2 тепень ограничения фага Ъ ;р , выращенного на штамме Штамм Е.со 1 Д С 5183 со 1 1 С 518 несущем плазмиду р Ь 13 и рекомбинантныеплазмидыЬО Л ЬИГ ЗЬЦ В р П 11 ЦЧГ Р П) Й (5 "фЙ г .138 ф 10 5,2 104 104 1,6 10 1,0 10 рЫЧ 2 р 3 31,КМ 4 что позволяет его использовать в структурных исследованиях ДНК и опытах по получению рекомбинантных молекул ДНК.За базовый объект следует принять способ, описанный в качестве прототипа. Выход целевого продукта предло женным способом составляет не менее 203 или 6 х 10 единиц наг биомассы (сырой вес), что в 10 000 раз 10 больше по сравнению с базовым объектом. Полученный таким образом фермент имеет удельную активность 1,2 х ю 10 ед/мл (или 3 х 10 ед/мг белка), что в 2000 раэ больше, чем при при менении базового объекта).Препарат фермента, полученный этим способом, не содержит неспецифических эндонуклеаэ, на что указывает полное сохранение суперспираль ной структуры плазмидной ДНК р 3 Ь 233, не содержащей сайтов, узнаваемых эндо .нуклеазой рестрикции с .со при стократном избытке фермента и длительной инкубации. Полученный препарат фер мента полностью лишен эндонуклеаз и фосфатаз, так как Е .со О -ферменты ДНК способны соединиться с по.мощью ДНК-лигазы.Все вышесказанное указывает на 30 то, что данный препарат фермента может быть использован в экспериментах по генетической инженерии и структурнык исследованиях ДНК.1 Расстояние между участками узнавания эндонуклеазами рестрикции (сайтами) на ДНК фрагмент Сайт рестрикции Расстояние ДНКрЗЬК М 7 между сайтами вт.п.о.ф М) т,п.о. - тыс. пар. оснований.1040791 16 15 Табли ца 3 Очистка эндонуклеаэы рестрикции Е.со О Этап 60 100 30 40 20 12 70 3,8 20 300 1 У И Общая активностьфермента