Штамм бактерий еsснеriснiа coli rfl продуцент рестриктазы е со 105i

, -ЛЯ. Кюдулуткус и Э,-А577,15(088.8)Каталог фирмы 0 исследователь Дной ЭНЗИМОЛО кии 72) вичене,. В.П. 11 анелене, 11, П. Пятрушите.А.ЯнулайтисВ, 53) о-Лабе",88,(5 а з нологпродуцэндонемуюфрагм елокуловекторных конструироваДНК. лекул Цел ма Еяам лучение ВКПБ Вь изобретения - п Ьегс 1 па со 1 КРЬ - продуцента рест и расщепляющей п нуклеотндов 5 ТА иктаз следо уз- вательРс высо Нтамм хр шенком сост агаре под снового масл высу- онном я в лиофильно нии ием сте а мясоп ильного ия Е.со 13. ельную сред ЬслеДля культ05 применяю иро пит ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬПИЯМПРИ ПНТ СССР ОПИОАНИ(54) ИТАКИ БАКТЕРИИ ЕЯСНЕК 1 СН 1 А СОЬ 1КИ, - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗБ 1 Е СО 105 1.(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использованокак инструмент для получения фрагменбретение относится к биотехи и представляет собой штамм,ирующий сайт-специфическуюклеазу Е со 105 1, используак инструмент для получениянтом ДНК, картирования моле кои активностью.Итамм Еяспег 1 СЫа со 1 х КРЬ 105 характеризуется следующими признаками.Морфологические: клетки палочковидные, окрашенные фуксином клетки располагаются поодиночке, .попарно или в коротких цепочках, грамотрицательны, Неподвижны. в ДНК 9 картпрования молекул ДНК конструирования векторных молекул ДНК. Цель изобретения - получение штамма Еясйег 1 С 1 г 1 а со 1. КРЬ ВК 121 В(105) - продуцента рестриктазы, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 ТАССТА 9 с высокой активностью. При культивировании на питательной среде, содержащей, г/л дистиллированной воды: пептон ферментятс вный 10,0; дрожжевой экстракт 5,0 1","С 1 10,О; рН 7,0- 7,2 до конца фазы экспоненциального роста получают бактериальную массу с выходом 2,7-3,5 г с 1 л среды, Из 1 г биомассы получают 2000 ед рестриктазы Е.со 105 1. 1 табл,Культуральные: на питательном агре через 18-20 ч. роста образуют круглые, с ровным краем, блестящие, бсероватые колонии. При росте на питательном бульоне вызывают равномерное помутнение.Физиологические и биохимические:факультативный анаэроб, температурный оптиум 37 С, рН среды 6,8-7,3.Ферментирует до кислотообразованияглюкозу, сахарозу и лактозу. Не образует сероводород, образует индол.При росте не усваивает мочевину,на среде Симонса не растет, 163108 1дующего состава, г/л дистиллированной воды:Пептон ферментативный 10,0 Дрожжевой экстракт 5,0 ИаС 1 10,0 рН 7,0-7,2 Культивирование проводят притемпературе 370 С, рН 6,8-7,3, с хорошей аэрацией до выхода клеток в позд нюю логарифмическую фазу роста.Итамм ЕзсЬегдсМа со 1 КР 1. 105продуцирует в высоких количествахрестриктазу Е со 105 1, узнающуюи расщепляющую последовательностьнуклеотидов 5 ТАССТА.Рестриктаза характеризуется следующими свойствами: узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов5 ТАС 1 ТА в молекуле ДНК; оптимальноеФзначение рН для действия рестриктазы7,8-8,0; оптимальная температура действия 37-38 С, для активности рест 0риктазы требуются ионы Мя ; оптимальная концентрация Мифе 3-5 мМ.П р и м е р 1. Получение биомассы Е.со 1 ВР 1, 105,Для получения биомассы ЕзсЬег 3. -сМа со 1 КР 1, 105 используют лабора-,торный ферментер "Биолафит" (Франция),рН-метр, термэстат, круговые качалки,спектрофотометр СФ, лабораторнуюцентрифугу типа ЦЕПА (ФРГ), боксламинарный, автоклав, дистиллятор.Глубинное культивирование бактерий проводят на питательной среде(РН 7,3) следующего состава, г/л:Пептон ферментативный 10,0Дрожжевой экстракт 5,0ИаС 1 10,0Вода дистиллированная ОстальноеИнокулят готовят в колбы с 250 млпитательной среды из расчета 0,1- 0,2 Х суспензии бактерий, полученной при выращивании в 5 мл мясопептонного бульона в течение 3-4 ч (засеяно бактериологической петлей). Ноч" ной инокулят в объеме 500 мл засевают в лабораторный ферментер емкостью20 л (коэффициент заполнения 0,5). Культивирование проводят 4-5 ч до конца фазы экспоненциального роста. В процессе культивирования автомати.чески поддерживают рН на уровне 7,0.0.,3 путем подачи 20 Х-ного раствора Ф55 БаОН и изменения .числа оборотов мешалки с 200 до 400 об/мин, температура 3710,1 С. Бактериальную массу собирают посредством центрифугированияна проточной центрифуге типа ЦЕЛА(ФРГ) при 23000-25000 об/мин, фасуютее и хранят при -202 С, Урожай клеток составляет 2,7-3,5 г влажнойбиомассы с 1 л питательной среды,П р и м е р 2. Выделение сайтспецифической эндонуклеазы рестрикции Е со 105 1.Для выделения и очистки рестриктазы используют ультразвуковой дезинтегратор УЗДНТ (СССР), центрифугуБекман ЖС, холодильную камеру"Колора", хроматографические колонки, термостат, аппарат для электрофореза, универсальный источник питанияУИП.ДНК фага А выделена по известнойметодике (БаГо Н, Монга К.1. ВхосЬеш.Вормуз Асга, 1963, 72, 619-629). Используется гликоль бОСО, декстран 500фирмы "Негра".Активность рестриктазы тестируютметодом гидролиза ДНК фага 9 с последующим разделением полученных фрагментов электрсфорезом в агарозномгеле. Реакционная смесь для гидролиза содержит 10 мМ трис-НС 1 рН 7,8,20 мМ КаС 1 5 мМ МяС 1., 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 100 мкг/мл альбуминабычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага 9в 40 мкл смеси и 1 мкл фермента, Реакцию проводят при 37 С 10 мин, Электорофорез проводят в 0,1 М натрийборатном буфере (рН 8,2) 2 мМ трилон Б,в течение 1,5 ч при напряжении 100 Ви силе тока 100 мА. Окрашенные этидийбромидом (1 мкг/мл) гели просматривают в УФ-свете,За условную единицу принимаетсято количество фермента, которое воптимальных условиях за 1 ч полностьюрасщепляют 1 мкг ДНК фага Я Все операции по выделению и очистке фермента проводят при +4 С.10 г влажной биомассы суспендируют в 20 мл буфера А (10 мМ трис-НС 1-буфер, рН 7,8, содержащий 10 мМ 2-меркаптоэтанола), озвучивают на дезинтеграторе, В полученный бесклеточный экстракт добавляют полиэтиленгликоль (28,47) и декстран (7,17) добавляют МаС 1 до конечной концентрации 0,5 М. Все хорошо перемешивают на магнитной мешалке и центрифугируют со скоростью 4000 об/мин 30 мин. После центрифугирования верхний слой сливают и диализуют против буфера Б (10 мМ калийфос 5 163 фатный буйер, рН 7,4, содержащий 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ Фенилметилсульфонилйторида (РМБР), содержащего 0,1 М ИаС 1После диализа Ферментный раствор наносят на кслонку с йосйоцеллюлозой Р 11 (1,5 х х 12 см), уравновешенной буфером Б, 0,1 М ИаС 1, Колонку промывают этим же буфером и элюируют линейно новышающейся концентрацией ИаС 1 от 0,1 до 0,6 М и 300 мл буфера Б. Фракции, содержащие основную часть активности, объединяют и диализуют в течение 16 ч против буфера Б, 0,1 М ИаС 1. После диализа ферментный раствор наносят на колонку с ДНК-агарозой (1 х 12 см), уравновешенной буфером Б, 0,1 М ИаС 1. Промывают этим же буйером и элюируют линейно повышающейся концентрацией ИаС 1 от 0,1 М до 0,5 М в 140 мл буФера Б. Активные йракции объединяют и диализуют н течение 16 ч против буфера Б (10 мМ калиййосфатный буфер рН 7,4 содержащий 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ РМБР), Ферментный раствор после диализа наносят на колонку с гепаринсейарозой (1 х 8 см) уравновешенной буйером Б. Промывают этим же буйером и элюируют линейно повышающейся концентрацией ИаС 1 от 0 до 0,5 М в 100 мл буфера Б. Активные Фракции объединяют и диализуют в течение 16 часов против буйера Б, 0,1 М ИаС 1, После диализа йерментный раствор наносят на колонку с голубой сефарозой (1 х 7 см) уравновешенной этим же буйером. Колонку промывают буйером Б, 0,1 М ИаС 1 и элюируют линейно повышающей концентрацией ИаС 1 от 0,1 М до 0,7 М в 100 мл буфера Б.Фракции, содержащие основную часть рестриктазной активности, объединяют и диализуют против буфера Бф 10 мМ трис:НС 1 рН 7.4,1 мМ ДТТ 1 мМ ЭДТА,"0,1 М КС 1, 50% глицерина, 1 мМ РМБР и 200 мг/мг альбумина бычьей сыворотки, Ферментный препарат хранят при -20 С. Из 1 г сырой биомассы получают 2000 ед.рестриктазы Е со 105 1.Определение специфичности.Было установлено, что Е со 105 1 расщепляет ДНК йагаи И в одном месте и не действует на ДНКх 174 и рВЙ 322, Рассмотрение табличных данных позволило выявить только одну последовательность нукпеотидов10816 5 ТАССТА, узнаваемую рестриктазой Бпа В 1, удовлетворяющую указанным экспериментальным данным.Совокупность данных, представленных в таблице, убеждают, что субстратом Е со 105 1 является гексануклеотид 5 -ТАССТА.Наличие сведений о структуре участка, узнаваемого рестриктазой Е со 105 1, послужило предпосыпкой для апробации в опытах по определению места расщепления ДПК этим ферментом подхода, основанного на использовании в качестве субстрата синтетического олигонуклеотида, содержащего сайт узнавания (обведено рамкой) этого, фермента:5 СС Е со 10513 ССИспользуют самокоплементарные олигонуклеотиды. Каждый из меченых дуплетов обрабатывали рестриктазой Е со 105 1 и продукт расщепления анализировали в тонком слое ДЭАЭ- целлюлозы. В параллельных дорожках анализировали частичный 3 -экзонукле азный гидролизат меченого олигонуклеотида, входящего в состав исследуемого дуплекса, Наличие полного статистического набора продуктов экзону-клеазного гидролиза контролировали 35 путем его анализа методом нуклеотидных карт.Для рестриктазы Е со 105 1 меченым продуктом расщепления дуплексар зьоказался пентануклеотид 5 - Ф ССТАС, 40 что свидетельствует о расщеплении узнаваемого гексануклеотида в местах Ф 5 -ТАС СТА 3 -АТССАТ указанных стрелками.Предлагаемый штамм позволяет получить высокоочищенный йерментный препарат с большим выходом (2000 ед./г биомассы). Формула изобретенияШгамм бактерий ЕзсЬегсЬа со 1 ь БХЬ ВК 1 К В 4500 - продуцент рестрик тазы Е со 105 1.1631081 Сравнение расчетных и экспериментальных данных характера расщепления фрагментов ДНК фагов 3 и И рестриктазой Е со 105 1Субстрат Величины фрагментов.образующихся под действием Е со 105 1 (п.н.) Длина фрагмента,расщепленногоЕ со 105 1 (п.н.) гэ Бва 1 фрагментыДНК Фага ЯВаш Н 1 фрагментыДНК фага Я 12189 12200 19387 10157 6684 10000 6700 16841 Бас 1 фрагментыДНК фага ф 20040 12189 7851 12200 8000 Всп 1 фрагментыДНК фага И 1681 655 1710 640 2336 Ваш Н 1 фрагментыДНК фага И 2031 952 2050 940 2983 П р и м е ч а н и е. Р - величины фрагментов рассчитаны на основе известнойструктуры ДНК Фагов(Бапцег Р.З. Мо 1.Во 1., 1982, 162, 729-773) и И (ВесК Е,Мис 1, АсЫз Рсз., 1978. 5, 4495-4503), исходя из предположения, что Е со 105 Т узнает гексануклеотид 5 -ТАССТА.Э - величины фрагментов установлены методом относительной электрофоретической подвижности. 1 Составитель И. Привалов Редактор Л. Пчолинская Техред Л,Сердюкова Корректор А, ОсауленкоПроизводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина, 101 Заказ 524 Тираж 364 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5