Штамм бактерий еsснеriснiа coli-продуцент рестриктазы со130 1

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛ ИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИН 61 60 119 г ф ИЕ БРЕТЕНИЯ 7 с г. с"Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ О бьедиви опцсс о 11 Изобретение относится к биотехнологии, в частности к выявлению микроорганизма, способного продуцироватьрестриктазу, узнающую и расщепляющуюпоследовательность нуклеотидовСС (А/Т)(А/Т)СО и разванную, согласно общепринятой номенклатуре, Есо 1301,которая используется для исследования первичной структуры ДНК и вгенной инженерии,Целью изобретения является выявление штамма-продуцента ЕясЬегсЬ 1.асо 1 х ВКПМ В(КН.-130) рекстриктазы, узнающей и расщеппяющей последовательность нуклеотидов 5 С ГА/т А/т ГГ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО .ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР+саггу 1 п 8 сЬе Ьяй вп 1 р 1 аягЫ,Гепе, 1985, 33, 357-361. 1)5 Г 12 И 9/14, 1/2(54) Г 1 ТАММ БАКТЕРИЙ ЕЯСНЕВ 1 СН 1 А СОЕ 1 ПРОДУЦЕНТ РЕГТРИКТАЗЫ Есо 130 1 (57) Изобретение относится к биотехнологии, к выявлению микроорганизма, способного продуцировать сайт-специфическую энлонуклеазу-рестриктазу. Рестриктаза можег быть использована для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии. Культивирование продуцента ЕясЬегхсЬха со 1 ВКПМ В(ЛХ, 1301 проводят в ус-оловиях аэрации при 37 С на питатель - ной среде, содержащей, г/л: пептон 1; дрожжевой экстракт 5; ИаС 1 10, рН 7,0 - 7,2 до достижения оптичес кои плотности суспензии клеток 3,0-3,7 о, е. Очистку фермента проводят хроматографическим путем. Выход фермента составляет 40000 ед. на 1 г биомассы, 1 табл. Бтамм ЕясЬегсЬа со 11 130, продуцирует рестриктазу Есо 130 1 (изошизомер рекстриктазы Бгу 1) с высокой продуктивностью, что способствует повышению выхода целевогофермента в 20 раз по сравнениюс известным штаммом в продуцент,Итамм ЕясЬег 1 сЬа со 11 РР 1, 130получен из Республиканской санитарноэпидемиологической станции Литовской ССР.Используемый штамм ЕясЬегдсЬха со-,1 кРЕ 130 обладает следующими характеристиками,Морфолого-культуральные признаки.Клетки палочковидные, В стандартныхжидких средах встречаются по одиноч -ке, в парах или коротких цепочках,Подвижны.На мясопептонном агаре после 24 чинкубации в термостате при 37 С обраозует круглые С ровными краями, гладкие, блестящие колонии, величиной2,0-2,5 мм в диаметре. Колонии с агаром не срастаются, беловатого цвета. 10В мясопептонном бульоне образуютмутность.Физиологические признаки, Оптимальная температура роста 37 С. Грамоотрицательные, каталазоположительные, 15оксидазоотрицательные, Факультативный анаэроб.Лактозу, сахарозу, глюкозу окисляет. На среде Симонса не растет. Приросте Н Я не выделяет. 20Не усваивает мочевину. Усваиваетиндол.Клетки подвижные. Культура хранится в пробирках на среде МПА под слоемстерильного вазелиновога масла при 25температуре +4 С и в лиойилизированоном виде.Полученная рекстриктаза Есо 130 1характеризуется следующими свойствами: узнает и расщепляет последователь ность нуклеотидов 5 СфС(А/Т)(А/Т)СС 3 в молекуле ДНК; оптимальноезначение рН для действия рестриктазы 8,3-8,7; для проявления активности рестриктазы требуется М 8 , оптиЯ.+мальная концентрация 8-12 мМ,П р и м е р, Получение биомассыЕзсЬегхсЬа со 1 х КЛ, 130,Для получения биомассы ЕзсЬегхсЬ 1 асо 11 КР 1. 130 используют лабораторный 40Аерментер "Биолайит" (Франция), рНметр, термостат, круговые качалки,спектройотометр СФ, лабораторнуюцентрифугу типа ЦЕНА (ФРГ), бокс лами.нарный, автоклав, дистиллятор. 45Для поддержания и культивированияштамма используют две среды. Средадля поддержания штамма 1 представляет,собой мясопептонный бульон с добавлением до 21 агара. Среда для культивирования штамма 2 содержит, г/л: пептон 1; дрожжевой экстракт 5; МаС 11; рН 7,0 - 7,2,Агаризованную среду 1 разливают в пробирки по 5 мп и стерилизуют при 0,8 атм в течение 40 мин Компоненты жидкой питательной среды 2 стерилизуют при 1,0 атм в течение 20 мин,Гтамм ЕзсЬег 1 сЬ 1.а со 1.1 КЕ 1, 130.поддерживают в пробирках на среде 1под слоем вазелинового масла при +4 Си в лиоАилизированном виде. Для оживления культуру ЕзсЬегхсЫа со 11 КЕ 1,130 пересевают на чашку Петри с агаризованной питательной средой 1 иинкубируют при 37 С 18 ч, Оживленную культуру еще раз пересевают нанаклонный агар со средой 1 и инкубируют при 37 С 18 ч. Эатем культурубактериологической петлей переносятв пробирку с 5 мл стерильного мясопептонного бульона и инкубируют вотечение 3 ч при 37 С на качалках,делающих 220-250 об/мин, По 0,1 млполученной суспензии клеток вносят вдве колбы с 0,25 л среды 2 в каждой.Инокулят выращивают на термостати -рованных круговых качалках при 180200 об/мин, 37 С, в течение 18 ч.Оптическая плотность суспензии инокулята на СЭФпри длине волны540 нм составляет 6,0 о,е. Полученныйинокулят засевают в лабораторныйферментер "Биолайит", содержащий 10 лсреды Р 2,Культуру ЕзсЬег 1 сЬ 1 а со 11 КР 1, 130выращивают при 37 С, рН 7,0, со ско-ростью перемешивания в первый часкультивирования 200 об/мин и далеедо 400 об/мин, а также подачей стериального воздуха 4 л/мин в первыйчас роста с постепенным увеличениемдо 7 л/мин на третьем часу роста .Заданный рН во время Аерментацииподдерживают добавлением в среду 1 МортоАосАорной кислоты, Во.время культивирования периодически отбираютпробы и измеряют оптическую плотностьсуспензии клеток, Культивирование штамма проводят до поздней логариАмической Фазы роста - оптическая плотность суспензии клеток составляет3,7 о.е. (длина волны 540 нм, толщина кювет 0,5 см),Культуральную жидкость охлаждаютдо ф 4 оС и центрийугируют на проточной центрифуге типа ЦЕЛА при 2325,10 об/мин, Полученную биомассухранят при -2 О С, Выход сырой биомас,сы 3,80 г/л культуральной жидкости,Рестриктазу Есо 130 1 выделяют избиомассы клеток Е.со 1 КР 1, 130 путем разрушения, удаления обломковклеток центриАугированием с дальнейшей хроматограАической очисткойполученного бесклеточного экстракта.1618760Активность рестриктазы тестируютметодом гидролиза ДНК Аага ляибда с3последующим разделением полученных ефрагментов электроАорезом в агарозц5ном геле. Реакционная смесь для гидрролиза содержит 0,01 М трис - НС 1, рП8,5, 0,01 М МВС 1, 0,1 М МаС 1;0,00 М удитиотрейтол; 100 мкг/ип альбумица;р2 мкг ДНК в 40 мкл смеси и 1-5 мклферментного препарата. Реакцию проно- Сдят при 37 С 1 ч. Электрофорез проо,иводят в 0,1 И натрийборатном буАере,рН 8,2, 0,002 ЭДТА в течениепри днапряжении 100 В. Окрашенные этидий рбромидом (1 мкг/ил) гели просматрива- тют В УФ свете,За условную единицу активности при в энимается то количество фермента, ко- Дторое в оптимальных услови за 1 ч 20 рполностью расщепляет 1 мкг ДНК АагаЦлямбда, МИз 1 г биомассы получают 40000 единиц рестриктазы Гсо 130 1, фКачество препарата рестриктазы 25 эЕсо 130 Т определяют методом "рестрик- лция - лигирование - рестрикция . То,что Фрагменты ДНК, полученные при обработке ДНК Аага лямбда 10-кратцыилизбытком рестриктазы Гсо 130 1 в течение 16 ч,полностью ДНК-лигазой Т 4, алигаты полностью расщепляются этойкже рестриктазой, указывает на отсутчствие неспециАических нуклеаз и Аосфотаз в препарате рестриктазыЕсо 130 Т. 35Опр ед ел ение последов атель ностицуклеотидов, узнаваемой рестриктазойЕсо 130 . и места ее расщепления.При визуальном сравнении электроАо"ретических картин распределения ре 40стриктов, полученных в результате действия исследуемого Аермента Есо 130 1на ДНК Аага ляибда с рестриктоэлектрофореграммой рестриктазы Ягу 1, представленной в каталоге Аирмы Био-Лабс, 45 вбыло обнаружено большое их сходство,55 В связи с недоступностью известного препарата проверку идентичности субстратной специфичности Есо 130 1 и Ягу 1 проводят методом картирования. С использованием известных рестриктаз установлено, что единственная точка расщепления Есо 130 1 на ДНК РВК 322 находится в интервале 1360-1385 п.н. по часовой стрелке от Есо К. сайта, что хорошо согласовывается сместопо- ложением точки Ягу 1 на этой ДНК (1369 п,н,). Также определяют величиы рестриктов ЛНК Аага лямбда" ,обраонавшихся под воздействием исследумого Аериецта, и проводят картироваие точек расщепления иа этом субстатеТаким образом, экспериментально стацовлецные величины Арагментов хоошо совпадают с расстоянием между оследоцатепьцостяии 5 СС(А/Т)(А/Т)1Г, а также между ниии и сайтами исопьэованцых в опытах рестриктаз (си. аблицу). Полученныеаццые подтверж - ают предположение о том, что рестиктаэа Есо 130 Т узнает последова - ельцость 5 СС(А/Т)(АТ)СС.Для определения места расщепления той последовательности используют НК ппазииды рВй 32, Ее расщепляют/ естриктазой Гсо 130 Т, метили 5 - коц - и с помощью Т 4-палинуклеотидкина эы. еченую ЛПК дополнительно обрабатыват рестриктазой СГТ 3 1 и нужный субрагмецт (103 п.н) выделяют после лектроАореза в полиакриламидном гее. Для определения места расщепления роводят частичный гидролиз выделеного субАрагиента. Двухмерное разде- ение полученного гидролизата на ацеилцеллюлозе и гомохроматограАиейтонком слое ДЭЛА-целлюлозы приводит Аингерпринту, из которого выявлено, то гомологичной последовательностью участке расщепления является пентауклеотид 5 СА/ТА/ТСС. Следонательо, рестриктаза Гсо 130 1 расщепляет знаваемый участок между первым и торым основанием, образуя Арагмецты 5 выступающими липкими концамиС С А/Т А/Т (т 0.3Результаты исследований даны в аблице.Предлагаемый штамм позволяет полуить высокоочищенный препарат рестриказы Есо 130 1 и значительно повысить ыход целевого Аермента - в 20 раз о сравнению с известным (40000 ед/г сырой биомассы рестриктазы Есо 130 1 по сравнению с 2000 ед/г рестриктазы Ягу 1) . Полученный при использовании штамма Евсйегхсйа со 1 Ю 1. 130 Аерментный препарат отличается высоким качеством и успешно используется в работах по генной инженерии. Формула изобретения Нтамм бактерий Езсйегсйа со 1 д ВКМ В- продуцент рестриктазы ЕС 0130 1.- расчегные велнчнфансвленщюе велнчнергсгврнге Привалова СоставительТехред М.ДидГуньк Редак ектор М.Демчик к тираж /го комитета5, Москва,ЗаказВНИИПИ Подписноео изобретениям и открытиям35, Раущская наб., д. 4/5 при ГКНТ СССР осударстве 11