Способ получения пептидов и белков в бесклеточной системе трансляции

(54) СПОСОБ КОВ В БЕСЕЛ (57) Изобре лярной биол ТИДОВ ИТРАНСЛ я к мол ологии,ПОЛУЧГНИЯ ПЕПБТОЧНОЙ СИСТРЛГтение относитсогии и биотехн к Изобреной биоло состоят и стемы тра ное количрвую ом, что бескле ляции содержат тво субстратов сн ол екуля ние относится к и и биотехнолог ограничена им реакции,в энергии чередь источник ), Повышение со нентов н систе в пе (Атр этих и ержанияах имеет омпо рыв ног твода из продуктов реакпи сстановления исх ои кон ного ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР Н А ВТОРИЧНОМУ СВИДЕТЕЛЬСВ 4239148 /1329.04,8707.0191. Бюл, Р 1Институт белка АН СССИ.11.Алахов, В.И.Бараннодон, Л.А,Рябова и А577.217.3(088.8) 5 б) йоЬегсн В.Е. апс 1 Р1 ЯАБ, 1973, ч.71), И 8,но к использованию бесклеточных систем трансляции для синтеза биологически активных полипептидов 1 п чсгоЦелью изобретения является повыше - ние выхода целевого продукта за счет увеличения срока работы системы трансляции.На Аиг.1 и 2 приведены схемы, поясняющие способ,Разработан целый ряд бесклеточных систем трансляции на основе клеточных экстрактов из различных прокариотических и эукариотических организмов. Все эти системы характеризуются низкои эААективностью процесса и обыч но обеспечивают синтезлишь нескольких молекул полипептида на рибосому. Основные причины столь низкой эЬАектинности бесклеточных систем трансляции именно к использованию бесклеточныхсистем трансляции для синтеза биопогически активных полипептидов п чдСго. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта засчет увеличения срока работы системытрансляции. Способ препаративногосинтеза полипептидов и белкон и бесклеточной системе трансляции непрерывного действия предполагает непрерывный отвод из реакционной смесипродуктов реакции и непрерывное восстановление исходной концентрации низкомолекулярньгх нешестн, расходующих -ся н процессе трансляции. определенные пределы, при превышениикоторых наблюдается ингибированце системы трансляции. Продукты распадасубстратов реакции, н первую очередьАЛР, АМР, СОР, АосАаты и пиродтсдаты,являются ингибиторами системы трансляции. Сами продукты синтеза (полипептиды) также могут быть,ингибиторами отдельных стадий бесклеточнойсистемы трансляции. Описанные причины устраняются за счет непре о о реакционной смеси и и непре 1618761центрации низкомолекулярных веществ, расходующихся в процессе трансляции.Основная реакция (синтез) полипептида протекает в блоке 1 (фиг.1). В результате ее расходуются свободные аминокислоты, АТР и СТР и образуют 1 полипептид, АМР, ГОР и неорганический фосфат. Дпя предотвращенияостановки процесса из блока 1 происходит одно временно отбор СВР, АМР и Рф и подача ,СТР, АТР и аминокислот из блока 2. Отбор синтезируемого полипептида происходит (в блоке 3) через мембрану в резервуар, из которого буферный 15 раствор с полипептидом поступает в колонку с аффннним иммуносорбентом. На колонке происходит адсорбция полипептида на иммунном сорбенте, специфичном к целевому полипептиду. Для 20 более экономичной работы системы в блоке 4 происходит превращение образовавшихся АМР и Я)Р в АТР и СТР. Буферный раствор из блока 3 после адсорбции полипептида также проходит 25 через систему регенерации АТР и СТР и через полупроницаемую мембрану вновь поступает в реакционную смесь.П р и м е р 1. Синтез белка оболочки вируса мозаики костра (ВМЧ) на 30 матрице ВМч РНК 4 в эукариотической системе трансляции из зародышей пшеницы в стандартной системе и в установке непрерывного действия.Раствор (А) состоит из 20 мМ НЕРЕЯ, рН 7,6, 2,1 мИ М 8(оАс), 115 мМ35 КоАс, 1 мМ АТР, 25 мкМ ГТР, 250 мкМ спермидина, 25 мкМП 1 лейцина судельной радиоактивностью 24 Ки/ммоль и 25 мкМ каждой из остальных 19 ами нокислот. 3 мл инкубационной смеси, приготовленной на растворе (А), содержит 80 пмоль 08 Я рибосом, 20 пмоль ВМ 7 РНК 4, 3,7 оп.ед. А о белковой фракции Я 100, 150 ед. активности ин гибитора рибонуклеаз из плаценты человека, О, 1 мкг лейпептина, О, 1 мкг апротенина, 0,1 мкг пепстатина,0,1 мкг химостатина.Кинетика синтеза белка оболочки 50 в стандартной системе при 25 С предоставлена на фиг.2 (кривая 1) .В параллельном эксперименте в установке непреривного действия к 3 мл той же инкубационной смеси непрерывно подается раствор (А) со скоростью 0,6 мл/ч, а продукты реакции отводятся из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационную мембрану ХМ. В результате в камеру, содержащую бесклеточную систему трансляции, непрерывно подаются субстраты реакции (АТР, СТР, аминокислоты) и отводятся из нее продукты реакции (АМР, СПР, Р;, синтезированный белок оболочки).Кинетика синтеза, белка оболочки в такой системе при 25 С в течение 15 ч представлена на фиг,2 (кривая 2).Из сравнения кинетических кривых 1 и 2 (фиг,2) можно сделать следующие выводы.Стандартная бесклеточная система трансляции выходит на плато по синтезу белка через 1,5 ч.Количество синтезированного белка при этом составляет 0,76 пмоль белка оболочки на 1 пмоль рибосом.В установке непрерывного действия синтез белка оболочки идет линейно в течение исследованного интервала времени (15 ч), количество синтезированного белка за 15 ч 40 пмоль на 1 пмоль рибосом.В целом для. предложенной модели установки непрерывного действия эффективность синтеза белка за 15 ч возрастает более чем в 50 раз.Н р и м е р 2, Синтез белка оболочки фага МЯ 2 на матрице 2 МЯ 2 РНК в прокариотической системе трансляции Е.соТ в стандартной системе и в установке непрерывного действия.Раствор (А) содержит 20 мМ трис- . НС 1, рН 7,4, 10 мМ М 8 С 1, 100 мМ ИН 4 С 1, 1 мМ АРТ, 0,2 мР ГТР, 5 мМ креатин фосфата, 10 мкг/мп кр. фос - фаткиназы 25 мМСлейцина сИ,- .удельной радиоактивностью 348 мКи/ /ммоль и 25 мкМ каждой из остальных аминокислот. 3 мл инкубационной смеси, приготовленной на буфере (А), содержат 1 нмоль рибосом 70 Я, 1 нмоль МЯ 2 РНК 3 5 ед, А ф белковой фракции 8100. В параллельном эксперименте в установку непрерывного действия к 3 мп той же инкубационной смеси непрерывно подают раствор (А) со скоростью 0,5 мл/ч, а продукты реакции отводятся из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационную мембрану РМ-ЗО.В результате в камеру, содержащую бесклеточную систему трансляции, непрерывно подают субстраты реакции (АТР, ГТР,аминокисло 5161 ты) и отводят продукты реакции (Л 11 Р, ГОР, Р , синтезированный белок)..(Стандартная бесклеточная система трансляции выходит на плато по синтезу белка через 2 ч. Количество синтезированного белка при этом составляет 1,1 пмоль белка на 1 пмоль рибосом.Сравнивают кинетику синтеза белка оболочки в такой системе при 37 ОС в течение 15 ч с кинетикой синтеза в стандартной бесклеточной системе.В установке непрерывного действия в течение 15 ч синтезировано 11 пмоль белка на 1 пмоль рибосом.Таким образом, предлагаемый способ синтеза полипептидов в бесклеточной системе трансляции обеспечивает многократное повышение скорости реакции и функционирование системы в длительном режиме, В результате этого выход целевого продукта повышается в несколько десятков раз (по сравнению с прототипом).Достигаемая эААективность процесса позволяет использовать способ дпя препаративного синтеза активных полипептидов .и белков. Особо важное хо 8761зяйственное значение может иметь получение этим способом полипептидов длиной 15-50 аминокислотных остатков, поскольку производство их химическим путем является крайне дорогостоящим, а для методов генной инженерии - во многих случаях малодоступным.Формула изобретенияСпособ получения пептидов и белковв бесклеточной системе трансляции сиспользованием матричных РНК с последующим выделением и очисткой конечного продукта, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения выхода целевого продукта за .счет увеличениясрока работы системы трансляции,осуществляют непрерывное удаление из реакционной смеси синтезированного продукта, непрерывное восстановление концентрации расходуемых низкомолекулярных веществ аминокислот, АТР., СТР,регенерацию АТР и ГТР из образующихсяАМР н ГЛР с последующим возвращениемрегенерированных АТР и СТР в системутрансляции.1618761 Редактор Н. Гунь ж 11 Заказ Подпис НТ С НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям и 113035,Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина,юг 3са Составитель О.СкуратовскаяТехред М.Дидык Корректор Т,Палий