Способ расщепления клеток микроорганизмов

,и) 626 ца ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. А. Гуревич, Б. А. Фихте, И. А. Черкасов, В. Я титут биохимии и физиологии микроорганизмов АН СС 1) Заявитель(54) СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ КЛЕХ МИКРООРГАН ИЗМОВ Изобретение относится к способам расщепления (дсзиитсграции, сфера-и протопластизации) клеток микроорганизмов и мотсст быть исГ 10.ьзовяиа В цсООбпологичесих и биохикиссских, молекулярио-биологических исследованиях. в производстве вакцин, в пищевой и фармацевтической промышленности.Известны способы рясщсплеиия (дезцитеграции, сфера протоп;Гастизации) клеток микроорганизмов с помощью водорастворимых фсрмсцтиых препаратов литического действия, добавляемых в водные суспецзпи зПкрааи 1 х клсток.Общю 11 недостатками этих способов является большой расход дорапх фермент- ИЫХ ПРЕПЯРЯТОВ, ГЕ(1 РЯВЛЯСМЫй ХЯРЯКТСР их действия ца клеточные стсцкц ц цсвозмо)впасть извлечсиия литических фсрмеитов из расщсплециога (дезицтсгрцроваииого) клеточного материала,Извсстсп тяк 1 е спасоо эизимятссской обработки микробных клеток иммобцлизоваццым иа твердой поверхности литическим ферментам 1, состояшпй в продуваиии аэрозоля Гсидкостц, в микрокаплях которого иахадятся клетки микрооргаиизмов, через моиоГштиый ксрамичсский реактор с сетью кяалов, иа степках которых иммобилизовац литичсский фсмеит. При М. Ушаков, Н. А, Кравчеикокеев и А. Н. Силакова оседаииц микрокапсль иа степках кяиалов реактора клетки и 1 сроаргцзоз сопри- ГсасаотсЯ с .10.си,амц им.соб:(-,и.авапиаГО фСРМСЦТЯ И ИХ ООО 1 ОК: ЧЯС".)1 Иа Л 1 Ь ИсГОТСЧ. СПОСОО ГР 111 СИГХ В ХГСДЦ;1 П С ДЛ 5 и и Я кт и В Я 11 П 11 Г и та Г Р и 111 х х 1 ( к) О Г; 1111 з хв воздушио-каис Гьиаг среде.НСДОСТЯТОГС ТЯОГО СЦОСООЯ ЗЯ:,Ю.ГЯ;ТСЯ В том, та Ои и.1 сстрсгглцргсмы 1 рястер процесса, малу 0 11)01 зва,цтсл - пасть ц эсрсрРстц Впасть.ЦС,1110 ИЗООР СТ" Ц И и 5 и,15 СТ(51 РСгГЛ: Равацис процесса и н)вышсцис с;о эффсктивост 1 и праиьп птс ц, 1стц, чт аосс- ПСЧИВЯСТ ВЭЗМО 5 КГОСТЬ ООРЯООТ;Ц (.)ОЛ,и 1 к количеств практп сскп Вяткы.:. )ик)апг;- ПОВ.ДЛя ЭТОГО КЧСТКП Х;ИКраарГЯ;цзМОВ СС- псцдируат г, гпатоццчсском (д(ля дсзпитщраццц) 1 ЛИ Стсбцл 1:цРОВЯП:10.( ц:ОГОПц(ЕСКОЗГ (Д(51 ПРОТОПЛсСТИПОВс 11 Ц 1 Я П 1 И СфРРОПЛ ЯСТИ 1) ОВЯ Цси ) СО, СГы Х Г) Я С . )0( и Х И ПРОП(СкаОТ В 11.(1;1 Лис 10-11 ЗОТОиа.(1 ПС 51(и- МР сСРСЗ ПОДЛОГСи(, В 11(О,пс с 10 В )Ц:1(лтрамикрапористых грац(л( ячс (.1010 страсиця с рязмсром ясск 0.5- -10 .:к(1. Гряпуль диямет;)Ок 1 От 60;а 300 мк 1; яГСЛ 0 С;Ы В ИМ) )ЬСИО-ПОТОИЬИ Р(.:КТР, ООССПСЧИЬЯ 0 Ц) В);КГЯ 1 РС(ВВи 51 КЛСТс)К В исм и прсдслах ат 1 д 900 с.626118 Составитель Г. Гуревич Техред Н, Рыбкина Корректоры: В. Дод и О. Данишева Редактор М, Дмитриева Заказ 1694/13 Изд.655 Тираж 626 Подписное НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, К, Раушская наб., д, 4/6Сапунова, 2 Типография, пр. Предлагаемый способ отличается от известного тем, что в нем возможно регулирование процесса изменением времени контакта клеток с гранулами, существенноулучшены геометрические характеристики 5зоны контакта клетки с подложкой, несущей литнческой фермент (многоточечный,многократный контакт), что обеспечиваетдостижение заданной цели.Г 1 рнмер 1. Еультуру Е. Со 11 В выра Ощнвают на мясопептонном бульоне с аэрацией в течение 20 ч, Полученную клеточнуюмассу промывают водным раствором, содержащим 0,85% МаС 1, затем центрифугируют.Осадок ресуспендируют в 0,3%-ном растворе ХаС с 25 мг/мл ЭДТА до концентрации 10 кл/мл, и полученную суспензиюнасосом пульсирующего действия прокачивают через реактор, внутри которого помещены ультрамнкропористые ячеистые стеклянные гранулы размером от 60 до 300 мкмс иммобплизованным на них лизоцимом вколичестве 0,1 мг/г. Насыпной объем гранул равен объему проточного реактора исоставляет 10 мл. Рабочий объем реактора 255 мл. Насос пульсирующего действия обеспечивает подачу в реактор 20 доз суспензпи в минуту объемом по 0,8 мл, Времяобработки клеток в реакторе составляет3 мин при 20 С. Эффективность расщепленпя (дезинтеграции) клеток 90% от числа исходных.Пример 2. Культуру Е. Со 11 В выращивают на мясопептонном бульоне с аэрацией в течение 5 ч, Полученную клеточную 35массу дважды промывают в 0,05 М трисбуфере, затем центрифугируют. Осадок ресуспендируют в 0,05 М трис-буфере 1 рН 8,0)до концентрации 10 кл/мл. В суспензиювводят сахарозу до концентрации 0,5 М и 400,01 объема раствора ЭДТЛ с концентрацией 25 мг/мл,Полученную суспензию насосом пульсирующего действия прокачивают через реактор, внутри которого помещены ультрамикропористые ячеистые стеклянные гранулы размером от 60 до 300 мкм с иммобилнзованным на них лизоцимом в количестве 0,1 мг/г. Насыпной объем гранул равен обьему проточного реактора и составляет 10 мл. Рабочий объем реактора 5 мл,Насосом пульсирующего действия для получения сферопластов подают в реактор 60 доз суспензнн в минуту, а для получения протопластов 24 дозы суспснзии в минуту. Объем каждой дозы 0,5 мл. При этом время обработки клеток в реакторе составляет 10 с при получении сферопластов и 25 с при получении протопластов при 20 С. Эффективность получения сферонластов 70/о, протопластов 80%.П р и м ер 3. Культуру М 1 сгососсцз 11 эоде 1 с 11 сцз выращивают на мясопептонном бульоне с аэрацией в течение 24 ч. Полученную клеточную массу промывают водным раствором, содержащим 0,85% ХаС, затем центрифугуют. Осадок ресуспендируют в 0,3%-ном растворе ИаС 1 с 25 мг/мл ЭДТА до концентрации 10 кл/мл, и полученную суспензию насосом пульсирующего действия прокачивают через реактор, внутри которого помещены ультрамнкропористые ячеистые стеклянные гранулы размером от 60 до 300 мкм с иммобилизованным на них лизоцимом в количестве 0,05 мг/г, Насыпной объем гранул равен объему проточного реактора и составляет 10 мл. Рабочий объем реактора 5 мл. Насос пульсирующего действия обеспечивает подачу в реактор 20 доз суспензии в минуту объемом 0,5 мл каждая. Время обработки клеток в реакторе составляет 3 с при 20 С. Эффективность расщепления (дезинтеграции) клеток 95% от числа исходных. Формула изобретенияСпособ расщепления клеток микроорганизмов, предусматривающий ферментативное воздействие на клеточные стенки иммобилизованным на твердой поверхности литическим ферментом, отличающийс я тем, что, с целью регулирования процесса и повышения его эффективности и производительности, клетки микроорганизмов суспендируют в гипотоническом или стабилизированном изотоническом солевых растворах и пропускают в импульсно-проточном режиме через ультрамикропористую подложку, выполненную в виде гранул ячеистого строения с размером ячеек 0,5 - 10 мкм.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1, Патент СШЛ М 3849254, кл. 195 - 116, опублик. 1974.