Рекомбинантная плазмидная днк 33, кодирующая метилазу s 11, и штамм бактерий еsснеriснiа coli продуцент метилазы s 11

Р 200. Трансформанты высевают на сред с ампициллином и из выросших клонов в щеляют плазмиду, обозначенную как й 33.5Используют штамм бактерий Е. со 1 834 (г , т ), несущий плазмиду й 33 продуцируют метилазу Бяо 11,Штамм-продуцент метилазы Бяо 11 олучен трансйормацией клеток Е. со 1 1 О 834 плазмидой й 33, Содержание метилазы .зо 11 в сконструированном штамме авно 300000 ед. на 1 г биомассы клеок. П р и м е р. Получение плазмиды 15 33. Плазмидную ДНК из штаммасо 1 ХБ 13, содержащую двеазмиды; Р 4 (2,8 МД) и Р 9 (100 МД), ыделяют щелочным методом. ПпазмидДНК Р 4 отделяют от высокомоле улярной ДНК Р 9 с помощью хроматорайии на ДЕАЕ-целлюлозе, Качество азделения плазмид анализируют элетройорезом. В очищенных препаратахазмидной ДНК Р 4 присутствие нлаз иды Р 9 не выявляется.Плазмидную ДНК Р 4 и ДНК вектора УС 19 используют для конструированияазмиды й 33, которое проводят слеующим образом; 0,5 мкг вектора рП 1,9 инкубируют с эндонуклеазой рестикции Ватп Н 1 (5 ед,) в буйере А 10 О мМ ИаС 1 50 мМ трис-НС 1, рН ,5, 10 мМ М 8 С 1 , 1 мМ дитиотрейтол). мкг плазмидной ДНК .Р 4 инкубируют рестриктазой В 81 11 (10 ед.) в буере 10 мМ трис-НС 1, рН 7,5, 10 мМС 1 , 1 мМ дитиотрейтол. Инкубацию роводят при 37 С в течение 1 ч. атем пробы нрогревают в течение 40 5 мин при 65 С и анализируют полногидролиза с помощью электрофореза. Соединение ДНК плазмиды и вектора роводят в буфере, содержащем 0,05 М рис-НС 1, рН 7,4, 0,01 М МдС 1,0,01 М 45 ,итиотрейтол, 0,1 мМ АТФ. ДНК-лигазу ага Т 4 (100 ед/мл) добавляют из асчета 0,5 мкл йермента на 5 мкг ДНК. робу инкубируют 12 ч при 10"С,Затем в смесь соединенных йрагмен гов добавляют 1 мкг 0,5 М ЭДТА, экс 1 рагируют равным объемом хлороформа, переосаждают 2,5 объемами этанола,поСле растворения осадка ДНК пробу инубируют 12 мин при 65 С и обрабаты- . вают 10 ед. рестриктазы ВашН 1 в буфере А в течение 1 ч при 37 С с целью обогащения смеси соединенных йраг Ментов гибридными молекулами ДНК, Плазмиду й 33 трансйормируют в штамм Е. со 1 В 834 по методу, описанному в примере, получают штаммпродуцент метилазы Бзо 11. с активностью не менее 300000 ед/г биомассы клеток.Штамм Ез сЬегсЫа со 1 х В 834 сущий плазмиду й 33 (г , щ ) - п цент метилазы Бзо 11 характери ся следующими признаками.Культурально-йормологические признаки. не роду зуетПолученной смесью трансформируют клетки Е. со 1 рБ 200, для чего 50 мкл суспензии Е. со 1 РБ 200 вно-. сят в 20 мл питательного бульона ЬВ, выращивают до титра 7 х 10 кл/мл при 370 С во йпаконе объемом 200 мп. После чего суспензию клеток охлаждают во льду в течение 10 с и центрийугируют при 5000 я 15 мин при 4 С. Супернатант сливают. Осадок суспендируют в 1/2 объема 0,1 М СаС 1, После 40 мин инкубации во льду клетки осаждают центрийугированием и ресуспендируют осадок в 0,5 мл 0,1 М СаС 1 , Суспензию клеток выдерживают во льду 10- 12 ч, затем используют для трансформации.К 200 мкл суспензии клеток в СаС 1 добавляют 20 мкл смеси соединенныхфрагментов ДНК и выдерживают 40 мин во льду, затем на 90 с помещают в ледяную баню с температурой 42 С, после чего еще на 2 мин в лед. Суспензию разводят в 10 раз бульоном ЬВ и инкубируют 1 ч при 37 С, после чего высевают на чашки с ампицилли(50 / ). Извыделяют плазмидную ДНК. обозначенную как с 1 ЗЗ, содержащую в своем составе вектор рУС 19, несущий ген В 1 а, который детерминирует синтез р-лактамазы и плазмидную ДНК Р 4, несущую ген метилазы Бзо 11, определяющий синтез метилазы Бяо 11. Сайт узнавания рестриктазы В 81 11 лежит . вну;ери последовательности гена рестриктазы Бяо 11, поэтому при клонировании происходит встраивание внутрь гена рестриктазы ДНК вектора рУС 19, разобщающей этот ген, и синтеза рестриктазы Бяо 11 в клетках, несущих плазмиду с 1 33, не происходит.Плазмидную ДНК о 33 подвергают рестрикционному анализу.Характеристика штамма.2585 6Е. со 1, трансФормированных плазми"дой й 33.ШтаммТ 15 чения характера метилирования Яяо 11 20 25 30 40 45 50 55 5 153Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные, лактозопозитивные. При рассеве на чашкис 1,3%-ным МПА рост в виде отдельных,колонии, иногда в К-форме с неровными5краями. Хорошо растет на плотных ижидких питательных средах (МПА, МЛБ,1.В-бульон и ЬВ-агар).Физиолого-биохимические признаки,сКлетки растут в пределах 4-45 Спри оптимуме рН 6,8-7,5. Штамм разлагает глюкозу, лактозу, маннит с образованием кислоты, не .разлагаетсахарозу, сбраживает мальтозу, ксилозу, сорбит, дульцит, рамнозу, образует индол и сероводород,Проявляет устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленнуюналичием плазмиды с 1 33.Уровень синтеза метилазы анализируют следующим образом,1(ультуру клеток Е.со 1 В 834, несущих плазмиду с 1 33, выращивают в1 л среды Т.В с 50 мкг/мл ампициллина при 37 С до титра 4 х 10 кл/мл.Клетки осаждают центриФугированием(5000 д, 15 мин), 1 г сырой биомассысуспендируют в 5 мл буФера, содержащего 50 мМ трис-НС 1, рН 7,6, 0,1 МИаС 1, 7 мМ 2-меркаптоэтанол,100 мкг/мл лизоцима и выдерживают при0 С 10 мин, Клетки разрушают ультраозвуком. Экстракт получают центриФугированием при 2 С (48000 8) в течениечаса,Активность метилазы Бяо 11 определяют в реакционной смеси с общим объемом 100 мкл, содержащей 1 мкг акцепторной ДНК, 0,5 мк Ки Н Б-аденозилметионина и 5 мкл каждого из десятикратных разведений сунернатанта. Инкуба-цию проводят в течение различных временных промежутков от 1 до 24 ч при37 С. Пробы наносят на фильтры СР/С,осаждают 5%-ной трихлоруксусной кислотой, отмывают 70%-ным этанолом, высушивают и просчитывают радиоактивностьв толуоловом сцинтилляторе, За единицу Ферментативной активности принимают количество фермента, обеспечивающего полную модификацию 1 мкгакцепторной ДНК за 24 ч.Уровень активности метилазы, определенный в штамме Е, со 1 В 834, несущем й 33, соответствует 300000 ед.на 1 кг биосмассы.Ниже приведены значения уровнейсинтеза метилазы Бяо 11 в штаммах Активност метилазы, ед/гЕ.со 1 д РЯ 200/с 133 10000Е.со 1 В 834/ЙЗЗ 300000Рекомбинантная плазмида Й 33 представляет собой высококопийную, имеющую удобный селективный маркер, векторную молекулу, несущую ген метилазыБяо 11. Ллазмида й 33 может служитьосновной для проведения работ, имеющих теоретическое значение - для изуи определения первичной структуры гена метилазы, а также для практическихработ по созданию суперпродуцентов метилазы Бяо 11,Штамм бактерий ЕясЬегсМа соИ В 834, трансФормированный плазмидой й 33, является эффективным продуцентом метилазы Яяо 11 (уровень активности метилазы - 300000 ед. на 1 г биомассы). При этом в штамме. Е.со 1 х В 834 не продуцируется рестриктаза Яяо 11, сопутствующая метилазе Язо 11, близкая по Физико-химическим параметрам к белку метилазы Бяо 11. Этот Факт позволяет при работе с этим штаммом использовать наиболее легкую технологически схему очистки метилазы Бзо 11. 1Формула изобретения 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК Й 33, кодирующая метипазу Яяо 11, молекулярной массой 4,5 ИД и размером 7, 1 т.п.о., содержащая плазмидную ДНК вектора РН С 19 размером 2,7 т.п.а плазмидную ДНК Р 4 с геном метилазы Бяо 11 размером 4,4 т.п.о один участок разщепления зндонуклеазами С 1 а 1, ЕсоК 7, Яас 11, Ряг 1, Ярп 1, Н 1 пй 1 П, Б ас 1, Крп 1, Бша 1, ХЬа 1, участка расщепления Сйг 101, Яа 1 С 1, четыре участка расщепления ЕсоК 1, В 1 а ген, кодирующий р -лактамазу,фрагменты гена 1 ас, соединенные с синтетическим полнлинкером, расположенные по обе стороны клонированной ДНК Р 4, ген метилазы Бяо 11, расположенный на клонированной ДНК плазмиды Р 4, детерминирующей синтез метилазы Яяо 11, последовательность гена рестриктазы Бяо.11; состоящую из двух фрагментов, расположенных по обе стороны ДНК вектора1532585 Составитель Е. Кузнецова Редактор Т. Лазоренко Техред Л,Сердюкова Корректор Н. Король Заказ 8070/36 Тираж 501 ПодписноеВКИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская набс, д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина,101 РП сп зы С 19, которая, таким образом, ие собна определять синтез рестриктаБво 11. 2. Штамм бактерий ЕзсЬегхсЬда со 1 ьГИСК, В 834 - продуцент:метилазыБзо 11.