Штамм бактерий sеrrатiа маrсеsсеns, используемый для трансформации днк с геном устойчивости к ампициллину

9) 01) 2 И 1/20 9 4 ОСУДФРСТВЕННЫЙ НОМИЩ:О ИЗОБРЕП:НИЯМ И ОткоцтИНМПРИ ПНТ ССОР ИСАНИЕ ЕТЕНИЯ)19 30арствениый униянова-Ленинав, О.В,ПорфирьеБа",. госу И Ул утдива8,8)до 1,509. 1973, у 9 11 Исаевагия, 1987 Л. и дрЦ 9 1 о ШТАММ БАКТЕРИЙ ЯЕВЗАТХА, ИСПОЛЬЗУЕМ 9 Й ДПЯ ТРАНСФС ГЕНОМ УСТОЙЧИВОСТИ К АМП БИ(54 СЕЮ ДНК ЛИНУ (57 Изобретение относится к микробиологической промышленности, представляет собой новый штамм бактерий БеггаГы шагсевсепз, неспособный продуцировать.внеклеточную эндонуклеазу (К.Ф.3,1.4,9), чувствительный к ампициллину, и может быть исполь" зован в генетических исследованиях и получении штаммов - продуцентов биологически активных веществ.Цель изобретения - получение штам ма Веггаг).а шагсеасепзВКПМ В(33), отличающегося отсутствием способности продуцировать эндонуклеазу и чувствительного к ампициллину.Штамм предлагается использовать как рециииент для введения в него м продуцентов веществ поев клетки К актив(21) (22) (46) (71) верс (72) ва и (53) (56)19 4392446/3 15.03.88 15,08,90. Казанский тет им, В О.А.Гимад Д.В.Юсупо 577.15(08 1. Васгег р. 508 - хнабатян - Биотех с. 14-16. зобретение относится к микро биологической промышленности ипред тавляет собой новый штамм бактерий еггагда шагсезсепз ВКПМ В( 33), неспособный продуцироватьвнеклеточную эндонуклеазу 9 чувствительный к ампициллину. Штамм можетбыть использован в генетических исследованиях и получении штаммовпродуцентов биологически активныхвеществ, Цель изобретения - получение штамма ЯеггаГа шагсевсепз ВКПМВ(33), отличающегося отсутствием способности продуцировать внеклеточную эндонуклеазу, чувствительного к ампициллину. Использованиепредлагаемого штамма делает невозможным отбор трансформированныхклеток и выделение иэ них плазмиднойДНК. 2 табл. методом трансформации рекомбинантн молекул, несущих гены биологически активных веществ и устойчивости к ампициллину и создания таким обра на его основе штаммов - суперпроду центов.Создание штакмовбиологически егивныхдусматривает введениебактерий. посредством трансформации рекомбинантных молекул ДН , несущи наряду с геном биологически ного вещества ген устойчивости ккакому-либо антибиотику, Последующий отбор клеток, содержащих реком бинантные молекулы ДНК, ведется по устойчивости к этому антибиотику.Высокая нуклеазная активностьклеток 8, шагсевсепв затрудняет введение в них рекомбинантной ДНК, с помощью трансформации; Высокая устойчивость штаммов Я, шагсезсепз кбольшому числу антибиотиков, в томчисле к ампициллину, затрудняет отбор клонов, несущих рекомбинантныемолекулы, и делает невозможным использование большинства векторов,несущих ген устойчивости к ампициллину.Штамм получен методом индуцированного мутагенеза при облучениимузейного штамма Беггайьа шагсезсепзВи 211 АТСС 9986 ультрафиолетовымсветом с последующим отбором колоний, не обладающих эндонуклеазнойактивностью. На следующем этапекультуру, полученную из колонии,не обладающей эндонуклеазной активностью обрабатывали Б-метил-Ю-нитрозо-И-нитрогуанидином с последующим отбором колоний, чувствительныхк ампициллину.Штамм Б, шагсезсепз У 33 имеетследующие свойства,Морфология, Клетки палочковидныеразмером 0,6-0,5 х 1,0 мкм, одиночные,парные или соединенные в цепочку,грамотрицательные, подвижные.Культуральные и физиологическиесвойства. На МПА,через 24 ч ростаблестящие гладкие колонии ярко-к расного цвета, выпуклые, с ровным краем, диаметром 1,5-2,0 мм, На картофеле - блестящий красный налет. Молоко свертывает, но не пептонизи,рует, желатин разжижает,Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, сахарозу, мальтозу,сорбит, инозит, маннит, салицилат. Неферментирует лактозу, адонит, дульцит,ксилозу, арабинозу, рамнозу, Не расщепляет мочевину. Сероводород, индол не образует. Реакция Фогес-Проскауэра положительная, реакция с метил-рот - отрицательная, Оптимальная температура роста 28-30 С, рНосреды 7,4-7,6,.Эндонуклеазная активность, Не образует зоны деполимеризации ДНК:вокруг колоний в процессе роста на индикаторной агаризованной среде в течение 24 ч, Эндонуклеазная активность не обнаруживается в культуральной жидкости штамма (определение по продуктам гидролиза ДНК) при выращивании в течение 36 ч на качалке (180-300 об.мин 1) на модифиииоованной среде Бантинг. Следоваяэндонуклеазная,активность (1;04,0 виск. ед. мл.- в культуральнойжидкости и 0,5-.1,0 виск. ед. мг-"белка в клеточных лизатах) обнаруживается вискозиметрическим Методом.10 Чувствительность к ампициллину,Штамм не растет на мясопептонномагаре при концентрации ампициллина25 мкг на 1 мл среды.П р и м е р 1. Попучение штамма,неспособного продуцировать внеклеточную эндонуклеазу, чувствительно"го к ампициллину.Исходный штамм ВиАТСС 9986выращивают на мясопептонном агарев течение 1 8 ч при 28 + О, 5 С. Выросшие клетки смывают 0,53-ным физиологическим раствором, осаждают центрифугированием и ресуспензируют в0,1 МБа-фосфатном буфере до величи ны оптической плотности 0,12-0,15при 650 нм, Полученную суспензиюклеток облучают бактерицидной ультрафиолетовой лампой Буфна расстоянии 60 см в течение 100 с. К облученной суспензии добавляют мясопептонный бульон (1/3 объема суспензии)и инкубируют в темноте в течение3 ч при 28 С. После инкубированияоклетки высевают в чашки Петри с мя сопептонным агаром, в который быпдобавлен индикатор (для выявленияпродуцентов эндонуклеазы), содержащий 0,6 мг/мл дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)и 0,01% толуидиново го голубого, окрашивающий среду сДНК в голубой цвет, Вокруг колоний,выделяющих эндонуклеазу через 24 чроста, в результате гидролиза ДНКобразовывался ореол розового цвета.45 Отбирают колонии, не образующие зоны гидролиза ДНК на среде с толуидиновым синим, Все отобранные вари-.анты проверяли на эндонуклеазнуюактивность. В результате был отобран мутант, неспособный продуцировать неспецифическую внеклеточнуюэндонуклеазу.1Полученный мутанг засевают в колбы с мясопептонным бульоном до оптической плотности 0,05 при 650 нм,Культуру выращивают на качалке дооптической плотности 0,5, осаждаютклетки центрифугированием, промывают 0,1 М цитратным буфером, рН 5,5в 20 раз измеряли оптическое поглоще ние при 260 нм на спектрофотометре Сф, За единицу активности принимали количество фермента, которое дает увеличение оптической плотности в опытных образцах, по сравнению с контрольными (реакционная смесь без фермента) на одну оптическую единицу за 1 ч инкубации в пересчете на 1 мл культуральной жидкости (опт, ед. мл ч 9 . В качестве субстрата использовали препараты высокомолекулярной ДНК, выделенной иэ тимуса теленка по методу Кея в модификации Бенинга или коммерческИе препараты высокомолекулярной ДНК.Результаты определения внеклеточ. ной эндонуклеазной активности ис 20 ходного и предлагаемого штамма представлены в табл. 1.Как видно из данных табл. 1, не обнаруживается эндонуклеазная активность в культуральной жидкости и клеточных лизатах предлагаемого штамма У 33 по образованию кислоторастворимых продуктов расщепления ДНК. Обнаруживается следовая эндонуклеазная активность, равная 1,04,0 виск.ед. мл- и 0,5-1,0 виск,ед. мг- белка, в культуральной жидкости и клеточных лизатах штамма соответственно вискозметрическимметодомЭндонуклеазная активность в культуральной жидкости исходного штаммаАТСС 9986 на 36 ч выращивания равна 4000,0-6000,0 виск, ед, мл,960,0-1500,0 оптич, ед, млч - или1,6-2,5 мкМ расщепленной ДНК намл в 1 мин. В бесклеточных лизатах исходного штамма также обнаруживается высокий уровень эндонуклеазной активности, равный 90,0-100,0виск, ед, 35,0-40,0 оптич, ед.,0,05-0,07 мкМ мл минв расчетенамг белка,П р и м е р 3, Трансформацияклеток мутантного штамма Ф 33 (необладающего нуклеазной активностьючувствительного к ампициллину /пас.ашрам/ ДНК нлазмиды рУС 19, несущийген устойчивости к ампициллину.Ночную культуру штаммов Б, шагсевсепв 33 и 9986 засевают в МПБ и выращивают прн интенсивной, аэрации дооптич еской плотности О, 1 0-0, 1 5 при71 650 нм (1 10 ф - 20 кл/мл).Выросшие клетки осаждают на холоду 5 1585327 Затем клетки суспендируют в том же буфере до оптической плотности 0,4, добавляют В-метил-И-нитрозо-К -нитрогуанидин (Кос 1- 1 сМ) до концентрации 75 мкг/мл, инкубируют 30 минопри 37 С, После инкубации клетки осаждают центрифугированием, промывают 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,0, и рассевают в чашки Петри с мясопептонным агаром. Выросшие колонии проверяют на способность к росту на мясопептонном агаре с ампициллином(25 мкг/мл) и на эндонуклеазную активность . В результате отобран мутант Р 33, неспособный продуцировать неспецифическую внеклеточную нуклеазу и чувствительный к ампициллинуП р им е р 2. Изучение эндонуклеазной активности, Исходный штамм/Ви 211 АТСС 9986 и штамм У 33 выра-. щивают в течение 1 сут в пробирке со скошенным мясопептонным агаром, смывают 0,57-ным физиологическим раствором и засевают (из расчета1 мл инокулята на 1 00 мл среды) в колбу объемом 1 л со 100 мл среды. Бактерии выращивают на среде, содержащей,.г/л: глицерин 5,0; цитрат аммония 5,0; двузамещенный фосфат калия 10,0; сернокислый магний 0,5; хлористый натрий 0,5; сернокислое железо 0,05; гидролизат казеина 1,0; дрожжевой экстракт 3,0, рН среды 7,6, Выращивание ведут на качалке35 (180-200 обмин ) при оптимальной температуре 28 ф 0,5 С в течение 36 ч. Затем бактериальные клетки отделяют центрифугированием при 6000 я 20 мин. Клеточные лизаты получают 1 -кратным 40 замораживанием бак териальных клеток с последующим оттаиванием. В надосадочной жидкости и клеточном лизате определяли эндонуклеазную активность вискозиметрически и по продуктам 45 гидролиза высокополимерной ДНК, растворимым в 27.-ной НС 104. Реакционная смесь объемом 1,0 мл содержала 1 мг ДНК; 0,07 М трис-буфера, рН 8,5;0,007 М М 8804, 0,1 мл культуральной 50 жидкости, освобожденной от микробных клеток. Реакционную смесь инкубировали 15-20 мин при 37 С, реакцию останавливали добавлением 4 Х-ного раствора охлажденной НС 10 в объеме, 55 равном объему реакционной смеси. Осадок удалялИ центрифугированием на холоду при 6000820-30 мин. В над,осадочной жидкости после разведения1585327 на мл культуральной жидкости Активность эндонуклеазы,на мг белка клеточногоШтамм лизата мкМ расщепленнойДНК, мл миноптич. ед. виск, ед,1 6-25 ю.960-1500 35,0-40,0 0,05-0, 07 1 0-5 О 0,5-1,0 9 33 Не обнаружена Не обнаружена Не обнаружена Не обнаружена Таблица 2 Испытуемый штамм К ол ич ес тв о устойчивых к ампицилКоличество Наличие плазвзятых длятрансформации реципиентных клемиды в клетках,выросших на среде с ампициллином после трансформации лину клетокпосле трансформацииплазмидойр 1 С 19 ток 350 Сплошнойрост в течение 4 мин при 4000 я и отмывают от питательной среды холодным раствором, содержащим.10 мМ трнс-НС 1 (рН 8,0).Отмытые клетки вновь осаждают при тех же условиях. Осадок ресуспендируют в половине начального объема охлажденного во льду раствора, содержащего 30 мМ СаС 1 , 1 О мМ трис-НС 1 (рН 8,0) и выдерживают в течение 15 мнн во льду. Клетки вновь осаждают и ресуспендируют в 1/15 начального объема выше указанного раствора, Затем суспензию оставляют на 20 ч при 40 С, после чего к ней добавля-, ют раствор плаэмидной ДНК р 1 С 19 в количестве 1 мкг. и выдерживают при 4 С в течение 30 мин. Затем пробы опереносят в водяную баню, нагретую до 42 С, и.выдерживают в течениео2 мин. После инкубации проб при 42 С к ним добавляют по 1 мл МПБ и ставят в термостат на 30 С на 1 ч, Затем клетки высевают на МПА, в который ВиАТСС 9986 4000-6000 900-100,0у 33 - мутантный 1,210 ь У 9986 - исходный 1,5 к 0" в качестве селектирующего агентр,Добавлен ампициллин в концентрацйи200 мкг/мл. Посевы инкубируют при30 С в течение 48 ч, после чего подсчитывают количество устойчивых кампициллину клеток. Наличие в клеткахплазмидной ДНК определяли методомщелочного лизиса с последующим электрофорезом в агароэном геле,Результаты эксперимента представлены в табл. 2.Как видно из данных табл2,использование для трансформации клеток исходного штамма, обладающегонуклеазной активностью и устойчивостью к ампициллину, делает невозможным отбор трансформированных клетоки выделение из них плазмидной ДНК,20 Формула изобретения Штамм бактерий Яегга 1 а шагсевсепв ВКПМ В, используемый для трансформации ДНК с геном устойчивости к ампициллину.Таблица 1