Способ получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Номер патента: 1419717
Авторы: Езикян, Клящицкий, Краснопольский, Митина, Орехович, Сенников, Соловьева, Французова, Швец
Текст
(19) 111) 1)4 В О 1,) 20 26 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ЕТЕЛЬСТ К АВТОРСКОМ(21) 414 (22) 29. (46) 30. (71) Инс 3143/31-009,8608.88. Бюлтитут биолмии АМН ФИЧЕС- ФИБРОУ 3 огиче СССР, мичес и Хар одств кои и медиМосковскийой технологии нскои хи овское пре бактерийныхтина ева, ский граЕ, В 1 пй 1 п 81 аяг яыгЙасесо 11 ацеп.20, р. 1-5. УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ институт тонкои хи ким.М.В.Ломоносова ькприятие по произв упрепаратов"1 пС.,1. Сапсег"1977. ч 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИХ АДСОРБЕНТОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯКТИНА И КОЛЛАГЕНАЗ7) Изобретение относится к хим полимеров и позволяет получать биоспецифические адсорбенты для выделения фибронектина и коллагеназ, имеющие емкость по выделяемым веществам2,0-2,6 мг/мг лиганда, Это достигается использованием в способе получения биоспецифических адсорбентовдля выделения фибронектина и коллагеназ путем активирования нерастворимой матрицы и последующего ковалентного связывания ее со специфическим лигандом фрагментов оС -цепимолекулы коллагена или с 6 1 СВ 7-бромцианового пептида коллагена в качестве лигандов, 1 табл, 1419717Изобретение относится к химииполимерон, а именно к способу получения биоспецифических адсорбентондля выделения фибронектина и коллагеназ, и может быть использованов биохимии и медицине,Целью изобретения является повышение емкости адсорбентон по фибронектину и коллагеназам, 10В качестве специфических лигандовв способе используются оС -цепи коллагена или Ы, 1 СВ 7 пептид, получаемыйфбромцианоным щеплением м.1 -цепиколлагена. 15П р и м е р 1. 140 мг лиофилизованного коллагена из кожи крыс растворяют в 70 мл 0,5 М уксусной кислотыов течение 16 ч при 4 С, Раствор диализуют против 8 л 0,06 М натрий-ацетатного буфера, рН 4,8, за 16 ч при4 С и затем нагревают при 45 С н течение 30 мин, Полученный растворфильтруют, вводят на колонку с целлюлозной КМ(2,5 х 25 см), уравнове 25шенной 0,06 М натрий-ацетатным буфером, рН 4,8 и элюируют линейнымградиентом Г 1 аС 1 (О0,1 Г 1) в том жебуфере. Смеситель для градиента двухкамерный, по 400 мл в каждой камере, 30общий объем - 800 мл, Хроматографиюопроводят при 42 С, Скорость тока200 мл/ч. Фракции анализируют попоглощению при 230 нм. Соответствующие фракции, содержащие о,М, ++ / , (, и Ы. -компоненты, диализуют против 01 И уксусной кислотойи лиофилизуют. Суммарный ныход побелку 5021 (о, цепь - 9,52 мг, Ы -18,4 мг, (3- 7,76 мг, (3, - 22,5 мг, 40о, + Ь - 12,09 мг),Лиофилизованные о, - или /3 нфрагменты (по 180 мг) растворяют в40 мл 70/ меравьиной кислоты и инкуобируют 4 ч при 37 С под азотом с 450,5 г ВгСЯ. Затем смесь вводят наколонку с сефадексом С(1,8 хх 60 см), уравновешенным 0,1 М уксусной кислотой. Скорость тока 45 мл/ч,Фракцию, выходящую с исключающимобъемом колонки, лиофилизуют и получают 165 мг смеси бромцианоных пептидов о, -цепи коллагена. Получено7,5 мг Ы 1 СВ 7-пептида коллагена.Лиофилизованный о 1 СВ 7-пелтидколлагена (20 мг) растворяют н 10 мл0,1 М БаНСС , рН 8,4, содержащего0,15 М БаС 1 добавляют 10 мл бромциан-актинированны сефарозы 4 В и суспензию перемешивают н течениео16 ч при 4 С, Затем сорбент промывают 50 мл того же буфера, 50 мловоды и перемешинают 2 ч при 20 С с10 мл 1 М растнора этаноламина, оттитронанного 6 нНС 1 до рН 9. Сорбент отделяют и промывают по 50 мл0,1 М натрий-ацетатного буфера с 1 МГ 1 аС 1 рН 4,5 и 0,1 М натрий-боратного буфера с 1 М Г 1 аС 1 рН 9,0(операцию повторяют трижды). Затемсорбент промывают водой и хранятов виде суспензии н воде при 4 С вприсутствии 0027. азида натрия.Количество присоединенного Ы,1 СВ 7 пептида определяют по содержанию оксипролина в гидролизате аликнотыадсорбента,П р и м е р ы 2-9, Аналогичнополучают адсорбенты на основе сефарозы 4 В или СЕВ сферона 1000 итойопала НИс М, - и о -цепями,1 Э - и (3, -компонентами,о 1 СВ 8 бромциановым пептидом и желатином,Свойства полученных сорбентовпредставлены в таблице,П р и м е р 10, К 6 г силикагеляМСАдобавляют 35 мл толуола и2,5 мл 3-(2,3-эпоксипропокси)пропилтриметоксисилана, вакуумируют на роторном испарителе 5 мин и кипятятопри перемешивании 10 ч при 110 С.Сорбент промывают на фильтре 70 млтолуола, 140 мл ацетона и высушивают.К полученному продукту добавляют167 мл 0,1 н,НС 1 н ацетоне и перемешивают 2 ч при 20 С. Сорбент промывают 100 мл воды до рН 7 промывныховод и сушат в вакууме лри 80 С.Полученный сорбент суспендируютв растворе 0,256 г периодата натрияв 200 мл воды и перемешивают в течеоние 1 ч при 20 С, Затем сорбент промывают 300 мл воды и перемешивают вОтечение 16 ч при 20 С с раствором100 мг К, -цепи н 50 мл воды, послечего продукт промывают 100 мл воды,суспендируют в 50 мл 0,1 М бикарбонатного буфера, рН 8,5, добавляют0,05 г бромгидрида натрия и перемеошивают в течение 1 ч при 20 С, Полученный адсорбент промывают 50 мл0,1 М натрий-ацетатного буфера,рН 4,5, содержащего 1 М Г 1 аС 1. и 50 мл0,1 М натрий-боратного буфера,рН 9,0, содержащего 1 Г 1 Г 1 аС 1 (операцию повторяют трижды), Затем сорбентопромывают водой и хранят при 4 С.з 14197Свойства адсорбента приведены втаблице,П р и м е р 11. (Хроматографияфибронектина плазмы крови человека5на адсорбентах, содержащих фрагментымолекулы коллагена),Инкубируют 1 ч при 20 С растворплазмы крови человека (лиофилизованную плазму из 60 мл крови растворяют 10в 30 мл 0,05 М трис-буфера, рН 7,4,с О, 15 М ХаС 1, 0,5 мМ РЮГ и 0,02%азида натрия) с 10 мл с, -сефарозы 4 В. Затем адсорбент упаковываютв силиконизированную стеклянную колонку, которую промывают тем же буферным раствором до отсутствия поглощения при 280 нм в элюате, Послеэтого колонку промывают уравновешивающим буферным раствором, содержащим 201 М мочевину (50 мл), и вымывают фибронектин тем же буфером с 4 М мочевиной (14 мл). В заключение колонкупромывают тем же буфером с 8 М мочевиной. Функции анализируют по поглощению при 280 нм. Фракции, содержащиефибронектин, диализуют против 0,1 Муксусной кислоты и лиофилизуют. Выходфибронектина 17 мг (94,4%). Чистотаполученного препарата подтверждена . 30данными электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия,П р и м е р 12. (Хроматографияколлагенаэы из культуральной средыфибробластов кожи человека наЫ.1 СВ 7-сефарозе).А. Коллагеназу выделяют из 5 лсреды осаждением сульфатом аммония(60% насыщения, В случае бессыворо рточной среды осаждение проводят вприсутствии сывороточного альбуминав концентрации 0,5%Осадок отделяютцентрифугированием, растворяют в0,01 М трис-НС 1 буфере, рН 7,5, содержанием 0,001 М СаС 1, и последиализа против этого же буфера раствор, содержащий 300 мг белка, вводятна колонку с КМ-целлюлозой, уравновешенной тем же буфером. Элюцию кол лагеназы проводят градиентом ИаС 1 (О -0,3 М) в 0,01 М трис-НС 1 буфере, рН 7,5, с 0,001 М СаС 1 со ско - ростью тока 0,1 мл/мин, Степень очистки на стадии ионообменной хроматографии - 30 раз. Полученный препарат коллагеназы используют далее для аффинной хроматографии, Коллагеназную активность определяют по гидролизуС 1-коллагена.Б, Сорбент ю 1 СВ 7-сефароза (5 мл упакованного объема) инкубируют 1 чопри 4 С с раствором 10 мг препарата коллагеназы, полученной в п.А, в 10 мл 0,05 М трис-НС 1 буфера, рН 7,4, содержащего 0,1 М ИаС 1, 0,001 М СаС 1 , 0,005 М РМЬГ и 0,05% Вг 11 35. Затем сорбент упаковывают в колонку (1,2 х 4 см), которую промывают при 4 С по 25 мл буфера А, буфера А с 1 М МаС 1, 0,05 М натрий-ацетатного буфера, рН 5,2, содержащего 0,2 М ЯаС 1, 0,00 1 СаС 1, 0,005 М РМВГ и 0,05% Вг 13 35. Хроматографию проводят при скорости тока 20 мл/ч, объем фракций - 1 мл, Фракции анализируют по поглощению при 280 нм и по коллагеназной активности, Коллагенолитическая активность распределялась в двух фракциях, элюированных буфером А, содержащим 1 М ХаС 1, и натрий-ацетатным буфером, Выход по активности 40%, степень очистки 10 раз.Формула изобретенияСпособ получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ путем активирования нерастворимого носителяи последующего ковалентного связывания его со специфическим лигандом, о т л и ч а ю щ и й - с я тем, что, с целью повьппения емкости адсорбентов по фибронектину и коллагеназам, в качестве специфического лиганда используют О -цепи молекулы коллагена иои сС 1 СВ 7-бромциановый пептид коллагена.1419717 Свойства адсорбентов с иммобилиэованными фрагментами молекулыколлагена Содержание иммобилизо Емкость по фибронектину(сравнительный по прототипу) 1,3 Ф В мг/г сухого веса матрицы Составитель Л, ЧуповаТехред Л,Олийнык Корректор, А. Тяско Редактор М. Бандура Тираж 519 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Заказ 4266/10 Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгорОд, ул, Проектная, 4
СмотретьЗаявка
4143143, 29.09.1986
ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ И МЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ АМН СССР, МОСКОВСКИЙ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА, ХАРЬКОВСКОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ ПО ПРОИЗВОДСТВУ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ
КЛЯЩИЦКИЙ БОРИС АБРАМОВИЧ, МИТИНА ВАЛЕНТИНА ХАРИСОВНА, ФРАНЦУЗОВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСЕЕВНА, СОЛОВЬЕВА НИНА ИВАНОВНА, ЕЗИКЯН ТИРУИ ИОСИФОВНА, КРАСНОПОЛЬСКИЙ ЮРИЙ МИХАЙЛОВИЧ, СЕННИКОВ ГЕОРГИЙ АНТОНОВИЧ, ШВЕЦ ВИТАЛИЙ ИВАНОВИЧ, ОРЕХОВИЧ ВАСИЛИЙ НИКОЛАЕВИЧ
МПК / Метки
МПК: B01J 20/26
Метки: адсорбентов, биоспецифических, выделения, коллагеназ, фибронектина
Опубликовано: 30.08.1988
Код ссылки
<a href="https://patents.su/4-1419717-sposob-polucheniya-biospecificheskikh-adsorbentov-dlya-vydeleniya-fibronektina-i-kollagenaz.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ</a>
Предыдущий патент: Реактор-полимеризатор
Следующий патент: Барабанная мельница
Случайный патент: Контактная колодка