Способ получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ

(19) 111) 1)4 В О 1,) 20 26 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ЕТЕЛЬСТ К АВТОРСКОМ(21) 414 (22) 29. (46) 30. (71) Инс 3143/31-009,8608.88. Бюлтитут биолмии АМН ФИЧЕС- ФИБРОУ 3 огиче СССР, мичес и Хар одств кои и медиМосковскийой технологии нскои хи овское пре бактерийныхтина ева, ский граЕ, В 1 пй 1 п 81 аяг яыгЙасесо 11 ацеп.20, р. 1-5. УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ институт тонкои хи ким.М.В.Ломоносова ькприятие по произв упрепаратов"1 пС.,1. Сапсег"1977. ч 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИХ АДСОРБЕНТОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯКТИНА И КОЛЛАГЕНАЗ7) Изобретение относится к хим полимеров и позволяет получать биоспецифические адсорбенты для выделения фибронектина и коллагеназ, имеющие емкость по выделяемым веществам2,0-2,6 мг/мг лиганда, Это достигается использованием в способе получения биоспецифических адсорбентовдля выделения фибронектина и коллагеназ путем активирования нерастворимой матрицы и последующего ковалентного связывания ее со специфическим лигандом фрагментов оС -цепимолекулы коллагена или с 6 1 СВ 7-бромцианового пептида коллагена в качестве лигандов, 1 табл, 1419717Изобретение относится к химииполимерон, а именно к способу получения биоспецифических адсорбентондля выделения фибронектина и коллагеназ, и может быть использованов биохимии и медицине,Целью изобретения является повышение емкости адсорбентон по фибронектину и коллагеназам, 10В качестве специфических лигандовв способе используются оС -цепи коллагена или Ы, 1 СВ 7 пептид, получаемыйфбромцианоным щеплением м.1 -цепиколлагена. 15П р и м е р 1. 140 мг лиофилизованного коллагена из кожи крыс растворяют в 70 мл 0,5 М уксусной кислотыов течение 16 ч при 4 С, Раствор диализуют против 8 л 0,06 М натрий-ацетатного буфера, рН 4,8, за 16 ч при4 С и затем нагревают при 45 С н течение 30 мин, Полученный растворфильтруют, вводят на колонку с целлюлозной КМ(2,5 х 25 см), уравнове 25шенной 0,06 М натрий-ацетатным буфером, рН 4,8 и элюируют линейнымградиентом Г 1 аС 1 (О0,1 Г 1) в том жебуфере. Смеситель для градиента двухкамерный, по 400 мл в каждой камере, 30общий объем - 800 мл, Хроматографиюопроводят при 42 С, Скорость тока200 мл/ч. Фракции анализируют попоглощению при 230 нм. Соответствующие фракции, содержащие о,М, ++ / , (, и Ы. -компоненты, диализуют против 01 И уксусной кислотойи лиофилизуют. Суммарный ныход побелку 5021 (о, цепь - 9,52 мг, Ы -18,4 мг, (3- 7,76 мг, (3, - 22,5 мг, 40о, + Ь - 12,09 мг),Лиофилизованные о, - или /3 нфрагменты (по 180 мг) растворяют в40 мл 70/ меравьиной кислоты и инкуобируют 4 ч при 37 С под азотом с 450,5 г ВгСЯ. Затем смесь вводят наколонку с сефадексом С(1,8 хх 60 см), уравновешенным 0,1 М уксусной кислотой. Скорость тока 45 мл/ч,Фракцию, выходящую с исключающимобъемом колонки, лиофилизуют и получают 165 мг смеси бромцианоных пептидов о, -цепи коллагена. Получено7,5 мг Ы 1 СВ 7-пептида коллагена.Лиофилизованный о 1 СВ 7-пелтидколлагена (20 мг) растворяют н 10 мл0,1 М БаНСС , рН 8,4, содержащего0,15 М БаС 1 добавляют 10 мл бромциан-актинированны сефарозы 4 В и суспензию перемешивают н течениео16 ч при 4 С, Затем сорбент промывают 50 мл того же буфера, 50 мловоды и перемешинают 2 ч при 20 С с10 мл 1 М растнора этаноламина, оттитронанного 6 нНС 1 до рН 9. Сорбент отделяют и промывают по 50 мл0,1 М натрий-ацетатного буфера с 1 МГ 1 аС 1 рН 4,5 и 0,1 М натрий-боратного буфера с 1 М Г 1 аС 1 рН 9,0(операцию повторяют трижды). Затемсорбент промывают водой и хранятов виде суспензии н воде при 4 С вприсутствии 0027. азида натрия.Количество присоединенного Ы,1 СВ 7 пептида определяют по содержанию оксипролина в гидролизате аликнотыадсорбента,П р и м е р ы 2-9, Аналогичнополучают адсорбенты на основе сефарозы 4 В или СЕВ сферона 1000 итойопала НИс М, - и о -цепями,1 Э - и (3, -компонентами,о 1 СВ 8 бромциановым пептидом и желатином,Свойства полученных сорбентовпредставлены в таблице,П р и м е р 10, К 6 г силикагеляМСАдобавляют 35 мл толуола и2,5 мл 3-(2,3-эпоксипропокси)пропилтриметоксисилана, вакуумируют на роторном испарителе 5 мин и кипятятопри перемешивании 10 ч при 110 С.Сорбент промывают на фильтре 70 млтолуола, 140 мл ацетона и высушивают.К полученному продукту добавляют167 мл 0,1 н,НС 1 н ацетоне и перемешивают 2 ч при 20 С. Сорбент промывают 100 мл воды до рН 7 промывныховод и сушат в вакууме лри 80 С.Полученный сорбент суспендируютв растворе 0,256 г периодата натрияв 200 мл воды и перемешивают в течеоние 1 ч при 20 С, Затем сорбент промывают 300 мл воды и перемешивают вОтечение 16 ч при 20 С с раствором100 мг К, -цепи н 50 мл воды, послечего продукт промывают 100 мл воды,суспендируют в 50 мл 0,1 М бикарбонатного буфера, рН 8,5, добавляют0,05 г бромгидрида натрия и перемеошивают в течение 1 ч при 20 С, Полученный адсорбент промывают 50 мл0,1 М натрий-ацетатного буфера,рН 4,5, содержащего 1 М Г 1 аС 1. и 50 мл0,1 М натрий-боратного буфера,рН 9,0, содержащего 1 Г 1 Г 1 аС 1 (операцию повторяют трижды), Затем сорбентопромывают водой и хранят при 4 С.з 14197Свойства адсорбента приведены втаблице,П р и м е р 11. (Хроматографияфибронектина плазмы крови человека5на адсорбентах, содержащих фрагментымолекулы коллагена),Инкубируют 1 ч при 20 С растворплазмы крови человека (лиофилизованную плазму из 60 мл крови растворяют 10в 30 мл 0,05 М трис-буфера, рН 7,4,с О, 15 М ХаС 1, 0,5 мМ РЮГ и 0,02%азида натрия) с 10 мл с, -сефарозы 4 В. Затем адсорбент упаковываютв силиконизированную стеклянную колонку, которую промывают тем же буферным раствором до отсутствия поглощения при 280 нм в элюате, Послеэтого колонку промывают уравновешивающим буферным раствором, содержащим 201 М мочевину (50 мл), и вымывают фибронектин тем же буфером с 4 М мочевиной (14 мл). В заключение колонкупромывают тем же буфером с 8 М мочевиной. Функции анализируют по поглощению при 280 нм. Фракции, содержащиефибронектин, диализуют против 0,1 Муксусной кислоты и лиофилизуют. Выходфибронектина 17 мг (94,4%). Чистотаполученного препарата подтверждена . 30данными электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия,П р и м е р 12. (Хроматографияколлагенаэы из культуральной средыфибробластов кожи человека наЫ.1 СВ 7-сефарозе).А. Коллагеназу выделяют из 5 лсреды осаждением сульфатом аммония(60% насыщения, В случае бессыворо рточной среды осаждение проводят вприсутствии сывороточного альбуминав концентрации 0,5%Осадок отделяютцентрифугированием, растворяют в0,01 М трис-НС 1 буфере, рН 7,5, содержанием 0,001 М СаС 1, и последиализа против этого же буфера раствор, содержащий 300 мг белка, вводятна колонку с КМ-целлюлозой, уравновешенной тем же буфером. Элюцию кол лагеназы проводят градиентом ИаС 1 (О -0,3 М) в 0,01 М трис-НС 1 буфере, рН 7,5, с 0,001 М СаС 1 со ско - ростью тока 0,1 мл/мин, Степень очистки на стадии ионообменной хроматографии - 30 раз. Полученный препарат коллагеназы используют далее для аффинной хроматографии, Коллагеназную активность определяют по гидролизуС 1-коллагена.Б, Сорбент ю 1 СВ 7-сефароза (5 мл упакованного объема) инкубируют 1 чопри 4 С с раствором 10 мг препарата коллагеназы, полученной в п.А, в 10 мл 0,05 М трис-НС 1 буфера, рН 7,4, содержащего 0,1 М ИаС 1, 0,001 М СаС 1 , 0,005 М РМЬГ и 0,05% Вг 11 35. Затем сорбент упаковывают в колонку (1,2 х 4 см), которую промывают при 4 С по 25 мл буфера А, буфера А с 1 М МаС 1, 0,05 М натрий-ацетатного буфера, рН 5,2, содержащего 0,2 М ЯаС 1, 0,00 1 СаС 1, 0,005 М РМВГ и 0,05% Вг 13 35. Хроматографию проводят при скорости тока 20 мл/ч, объем фракций - 1 мл, Фракции анализируют по поглощению при 280 нм и по коллагеназной активности, Коллагенолитическая активность распределялась в двух фракциях, элюированных буфером А, содержащим 1 М ХаС 1, и натрий-ацетатным буфером, Выход по активности 40%, степень очистки 10 раз.Формула изобретенияСпособ получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ путем активирования нерастворимого носителяи последующего ковалентного связывания его со специфическим лигандом, о т л и ч а ю щ и й - с я тем, что, с целью повьппения емкости адсорбентов по фибронектину и коллагеназам, в качестве специфического лиганда используют О -цепи молекулы коллагена иои сС 1 СВ 7-бромциановый пептид коллагена.1419717 Свойства адсорбентов с иммобилиэованными фрагментами молекулыколлагена Содержание иммобилизо Емкость по фибронектину(сравнительный по прототипу) 1,3 Ф В мг/г сухого веса матрицы Составитель Л, ЧуповаТехред Л,Олийнык Корректор, А. Тяско Редактор М. Бандура Тираж 519 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Заказ 4266/10 Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгорОд, ул, Проектная, 4