Способ получения обратной транскриптазы из еsснеriснiа coli

(71) Институт цСО АН СССР 1 Ф 12итолог генетик т, И.О.Петр тари ковска ева Н.В., Коже- Сидельникова Салганик Р,И.-полимераза Н СССР, 1977,ехнолодля по- щего пе- рмации выше- к рипта- л 00 ранней логабавляют 750 мл концентрацией т насыщенным минометана до ри 5 - 7 С, замоом и разрушают генизаторе при тазы МЯЕ расэной с поткой, атог- иноэГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(53) 77.15.07 (088.8) (56) Патент США ЛЬ 4663290 кл. С 12 й 1/20, 1987,Ромащенко А.Г., Воробь мякина Н.Н., Потапов В,А. Н.П., Старообразова М.Г РНК-зависимая, ДН ЕзсЬегс1 а соИ. - Доклады А т. 233, с. 734-737,Изобретение относится к био ии и может быть использовано учения фермента, осуществляю реписывание генетической инфо РНК в молекулы ДНК.Целью изобретения является по ние степени очистки обратной транск эы из Е. соИ. Получение обратной транскри включает гомогениэацию клеток Е. со 600, экстрагирование белка буферны твором, фракционирование в двухф системе полиэтиленгликоль-декстран следующей хроматографической очи. включающей последовательную хро рафию на фосфоцеллюлозе, диэтилам(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБ.РАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ИЗ ЕЯСНЕЙСНА СОИ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения фермента, осуществляющего переписывание генетической информации с РНК в молекулы ДНК. Целью изобретения является повышение степени очистки обратной транскриптазы из Е. соИ. Получение обратной транскриптазы включает гомогенизацию клеток Е. соМНЕ-бОО, экстрагирование белка буферным раствором, фракционирование в двухфазной системе ПЭ Г-декстран с последующей очисткой методами колоночной хроматографии на фосфоцеллюлозе, ДЭАЭ-целлюлозе, сефадексе 0-100 и носителе Био-Рекс 70. Степень очистки 1358, удельная активность препарата 57000 ед/мг, выход по активности 2,8%, выход по белку 0,002%. 1 табл,тилцеллюлозе. сефадексе 6-100 и носителе Био-Рекс 70.Степень очистки и выход на каждой стадии приведены в таблице.Способ иллюстрируется примерами.П р и м е р. Получение обратной трансриптазы из Е. со.1. Разрушение клеток бактерий и поучение грубого экстракта.К 1,5 кг биомассы МКЕ-брифмической фазы роста доводного раствора лизоцима с2 мг/мл. Суспензию титруюраствором трис-(оксиметил)-арН 8,3, выдерживают 30 мин ираживают смесь жидким азотклетки в механическом гомо3. Хроматография на фосфоцеллюлозеР,Полученный на предыдущей стадиибелковый материал освобождают от полиэтиленгликоля, фрагментов нуклеиновыхкислот, других низкомолекулярных примесей, э также избытка соли путем пропускания через колонку с сефадексом 6-25(грубым, Ч = 8 л), уравновешенную 50 мМтрис-НС 1, рН 7,3, содержащим 50 мМ КС 1, инаносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р 11 (Ч = 400 мл), уравновешенную буфернымраствором того же состава. Разделение ведут в линейном градиенте КС 1 0,05 - 0,5 М в50 мМ трис-НС 1, рН 7,3 (общий объем градиента 4 л). Фракции, содержащие активностьобратной транскриптазы, обьединяют и ведут осаждение белка диализом против насыщенного раствора сульфата аммония, рН Ф о р м у л а и з.о б р е т е н и я 7,5. Осадок белка собирают центрифугиро- Способ получения обратной транскрипванием (9000 об,/мин, 45 мин).тазы из ЕзсЬегсна со МВЕ, включаю 8000 об,/мин в течение 10 мин. К полученному порошку разрушенных клеток добавляют 3000 мл 0,05 М трис-НС 1, рН 8,3, и с помощью механической мешалки ведут экстракцию в течение 1,5 мин, Экстракт осветляют центрифугировэнием (60 мин, 9000 об,/мин).Выход белка на этой стадии составляет 72 г; удельная активность фермента 42 е.а,/мг.2. Фракционирование в двухфазной системе полиэтиленгликоль-декстран.К 3300 мл полученного грубого экстракта добавляют 1095 мл 300 -ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ, мол,мас. 20000 О) и 200 мл 200 -ного раствора декстрана Т. Полученную смесь перемешивают в течение 30 мин при помощи механической мешалки. Затем центрифугируют 40 мин при 9000 об./мин. Верхнюю фазу отбрасывают, э к нижней добавляют раствор, содержащий 0,4 М КС 1, 50 мМ трис-НС 1 (рН 8,3) и 60 -ный раствор ПЭГ (мол,мас, 20000 О), из расчета 8 об. этого раствора на 1 об нижней фазы. После 30 мин энергичного перемешивания вновь разделяют фазы центрифугированием (40 мин, 9000 об./мин) и отбрасывают верхнюю фазу. К нижней фазе добавляют раствор, содержащий 4 М КС и 60 ПЭ Г (мол.мас. 60000) в 50 мМ трис-НС 1, рН 7,3, из расчета 3 об этого раствора на 1 об нижней фазы и перемешивают механической мешалкой 40 мин, Затем после 40 мин центрифугироваиия при 9000 об./мин декантируют верхнюю фазу и подвергают очистке содержащийся в нЕй материал.Выход белка 12,7 г.; удельная активность 76 е.а./мг. Выход по активности 32%. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Выход белка на этой стадии 120 мг удельная активность 2300 е.а./мг.4. Хроматография на диэтиламиноэтилцеллюлозе ДЕ,Полученный на предыдущей стадии белковый материал обессоливают на колонке с сефадексом 6-50 (средний Ч = 100 мл), уравновешенной 0,05 М трис-НС 1, рН 7,3, содержащим 50 мМ КС 1, и наносят на колонку с диэтиламиноэтилцеллюлозой ДЕ(Ч = = 100 мл), уравновешенную буферным раствором того же состава. Хроматографическое разделение ведут в линейном градиенте КС 1 0,05 - 0,5 М трис-НС 1, рН 7,3, Суммарный объем градиента 1;0 л. Хроматогрэфические фракции, содержащие белок с активностью обратной транскриптазы и не содержащие нуклеаз, объединяют, проводят осаждение белка диализом против суспензии сульфата аммония, как на стадии 3, и собирают белковый осадок центрифугированием.Выход белка 8,7 мг: удельная активность - 12000 е.а./мг.5, Гельфильтрация на сефадексе 6-100, Осадок белка растворяют в объеме 1 - 2 мл 0,05 М трис-НС 1, рН 7,3, содержащего 0,05 М КС 1, раствор осветляют центрифугированием и наносят белковый материал на колонку с сефадексом 6-100 (сверхтонкий, Ч = 100 мл, размеры колонки: диаметр 1 см, высота 70 см), Скорость нанесения и гель- фильтрации 12 - 14 мл/ч. Элюент - 0,05 М трис-НС. Фракции, содержащие белок с активностью обратной транскриптазы и не содержащие нуклеаз, обьединяют и проводят следующую стадию очистки.Выход белка на.этой стадии 6 мг; удельная активность 15000 е.э./мг.6, Хроматография на Био-Рекс 70.Белковый материал, полученный на предыдущей стадии, наносят на колонку (Ч = 2 мл) с Био-Рекс 70, уравновешенную 0,05 М трис-НС 1, рН 7,3, содержащим 0,05 М КС 1, со скоростью 4 мл/ч, Разделение ведут в линейном градиенте КО 0,05- 0,5 М трис-НС 1, рН 7,3 (суммарный объем градиента 20 мл) со скоростью 3 мл/ч; Фракции, содержащие обратную транскриптазу, обьединяют,Выход белка 1,5 мг (концентрация около 0,5 мг/мл); удельная активность 57000 е.а./мг,Фермент хранится в виде замороженного раствора при -20 С без потери активности не менее одного года,3 901 Тираж 365 ПодписнОе ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Г на, 10 щий разрушение клеток бактерий, экстрагирование белка буферным раствором, фракционирование со ступенчатым повышением концентрации соли в двухфазной системе полиэтиленгликоль - декстран и счистку методом колоночной хроматографии, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения степени очистки, фракционирование в двухфазной системе полиэтиленгликоль - декстран осуществляют со ступенчатым повышением концентрации КС до 3 М,а очистку методом колоночной хроматографии выполняют последовательно на фосфоцеллюлозе Р- в линейном градиенте концентрации КС от 0,05 до 0,5 М в буфере рН 7,3, 5 на ДЭАЭ-целлюлозе ДЕв линейном градиенте концентрации КС от 0,05 до 0,5 М в буфере низкой ионной силы, рН 7,3, на сефадексе 6-100 и на носителе Био-Рекс 70 в линейном градиенте концентрации КС от 10 0,05 до 0,5 М в буфере низкой ионной силы,рН 7,3.