Модифицированный макропористый кремнезем в качестве носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии белков и способ его получения

Е О ПИЗОБРЕТЕНИЯ р 540870 Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 24,10.75 (21) 2196534/Ос присоединением заявки Ло о 1) М. Кл.- С 07 Г 7/1 С 076 7/О В 010 15Государстевнный ком 3) Приоритет авета Министров СССРпо делам изобретенийи отхрытнй но 30.12.76. Бюллетень М 48 3) УДК 547,245.07(088,8) бли бликования описания 08.02,Дат) Авторы изобретения Б, Ю, Заславский, В, И. Лозинский, Ю,и С, В. РогожинОрдена Ленина институт элементооргсоединений АН СССР Давидович 71) Заявител ических(54) МОДИФИЦИРОВАННЪЙ МАКРОПОРИСТЫЙ КРЕМНЕЗЕМ В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЯ ДЛЯ ДИСУЛЬФИДНООБМЕННОЙ КОВАЛЕНТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ2 ермент акж очистки и иммобилизациииндивидуальных белков. лементо- носителентной получеВ качест менной ко продукт на зы содерж о-об есте дисульфи тографии и льного геля ости группы ве носителя дл алентной хромоснове гидрофи ащей на поверки ага валентная хроме для выделен СО - МИия ме ля выдел в, но онвозможн ных, так сти 1 в Изобретение относится к области органических соединений, а именно лю для дисульфидно-обменной кав хроматографии белков и опособу ег ния. Дисульфидно-обменная ко тография находит применениЭтот носитель используется д и очистки индивидуальных белк ет недостатки, ограничивающие его применения как в лаборато промышленных условиях.Одним из главных недостатко теля является низкая механичес его матрицы - агарозного геля малая устойчивость к воздейст ных температур и органических Он разрушается микроорганизм зя стерилизовать, набухаемость шой степени зависит от условий в такого носикая прочностьи, кроме того вию повышен растворителейами, его нель геля в боль среды. Способ получения указанного носителя заключается в активации полисахаридного агарозного геля бромцианом с последующей обработкой полученного продукта восстановленным глутатионом, после чего тиолсодержащий носитель обрабатывают 2,2-дипиридилдисульфидом.К недостаткам этого способа следует отнести необходимость, работы с ядовитым веществом - бромцианом, а также использование природного гормона - восстановленного глутатиона.д Известно также взаимодействие 1-оксо-ме540870 3тил-этокси-тиолан 4-метил - 5-она с лервичным аминомприводящее к 1 получению амидов а-меркаптокарбоновых кислот, а также использование модифицированного кремнезема для иммобилизации ферментов.Однако аминоалкилированный кремнезем не подвергался модификации 1-оксо-этокси- тиолан-оном и в качестве носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии белсков не использовался.Целью предлагаемого изобретения является получение носителя для дисульфидно-обмснной ковалентной хроматографии белков с улучшенными физико-механическими и биологическими Овойствами, а также разработка со 11 особа его получения.Эта цель достигается использованием в качестве носителя для дисульфпдно-обменной ковалентной хроматографии белков химически модифицированного макропористого окремнсзсма, содержащего на поверхности группу Отличительными, признаками описываемого носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии белков является использование;в качестве матрицы макропористого 0 0П р и м е р 1. Получение носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматогр афии белков.3 г аминоалкилированного макропористого кремнезема суспендируют в 10 мл сухого бензола, добавляют 0,5 мл 1-оксо-этокси-тиолаи-она (т, кпп. 76 С при 1 мм рт.ст.; п 0 1,4805) и перемешивают 6 часов при комнатной температуре. Растворитель отделяют декантацией, т 1 вердую фазу промыва 1 от бензолом (ЗХ 20 мл) апиртом (ЗХ 20 мл), деионизованной водой (20 мл), буферным раствором (0,1 М-Трис-НС 1 - 1 мм этилендиаминотетрауксусная,кислота (ЭДТА), рН 8,0) и суспендируют в 10 мл указанного буфера. К суспензии добавляют 5 мл раствора 0,5 г 2,2 дипиридилдисульфида в диметилформамиде и перемешивают реакционную смесь 6 час при комнатной температуре. Жидкую фазу отделяют, носитель промывают сухим бензолом (100 мл), водой (00 мл) и абсолюпным сниртом (200 мл); целевой продукт сушат в ва-(С,-, -СО-С,-8-8И кремнезема, а в качестве привитых группгруппы 1 сн 1 нн - со - он - с - -( ХСпссоо получения модифицированного макропористого кремнезема, содержащего на говерхности группу10заключается в том, что макропористый кремнезем, модифицированный -амипопропплтриэтсксисиланом, подвергают взаимодейс 1 вшо с 1-оксо-этокси-З-тиолан-оном, предпо 1 тительно взятом в пятикратном избытке по отношени 10 к аминогруппам носителя, В среде 20 инертного органического растворителя, например оензола, с последующей обработкой полученного продукта 2,2-,дипиридилдисульфидом в водноорганической среде при рН 7,2 - 8,5.Для ускорения этой реакции 2,2-дипиридил дисульфид желательно брать в пятикратномизбытке по отношеничо к числу с 5 Н-групп носителя в виде концснтрированного раствора в смешивающемся с водой органическом растВорителе, например ди 11 етилформамиде, ди:1 ОКс аНЕ, СЧИртЕ.Процесс протекаст по следующей схеме: куум-эксикаторе над Р,О 5. Количество активных к дисульфидному обмену групп, определен 11 ое спектрофотометрированием выделившегося при исчерпывающем восстановлении навсски носителя 2-тиопиридона, составляет 40 ммоль - Ь - 8-групп на 1 г полученного носитсл 51 для дисульфпдно-Обменной 1,Овалентной хроматографии.П р и м е р 2, Использование носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии при оч 1 гстке лизоцима белка куриных яиц. 1 О мл раствора буфера (0,1 М трис-НС 1 - 0,15 М 1 са-додецилсульфат - 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), содеркащего 50 мг лизоцима белка куринь 1 х яиц (марки В), восстановленного в денатурирующих условиях (2-меркаптоэтанолом в присутствии Ха-додецилсульфата) и освобожденного от избытка восстанавливающего агента гельхроматографией, в сосуде с мешалкой вводят в контакт с 1 г носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии и перемешивают 3 час при комнатной40 45 50 55 гемпературе, Затем отделяют твердую фазу, промывают ее и суспендируют в 5 мл буферного раствора (рН 8,0), содержащего 0,1 мл 2-меркаптоэтанола. Перемешивание ведут 4 час при комнатной температуре; фазы разделяют центрифугированием при 3500 об/мин в течение 10 мин, а надосадочную жидкость подвергают обессоливанию на сефадексе Г. Выход очищенного от низко- и высокомолекулярных примесей белка 39,6 мг,Г 1 ример 3. Выделение бычьего сывороточного меркаптоальбумина из препарата белка прп помощи носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии.100 мг бычьего сывороточного альбумина (С 1 есй, Польша) с содержанием остаточных липидов 2,7 ОЕ и 5 Н-титром 0,49+0,02 моль Н-групп на 1 моль белка растворяют в 20 мл буферного раствора (0,1 М трис-НС 1 - 4,15 М Ха-додецилсульфат - 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и в сосуде с мешалкой вводят в контакт с 2 г носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии. Перемешивают 2 час при комнатной температуре, промывают буфером (100 мл) дистиллированной водой (100 мл), 50%-ным этанолом (50 мл), деионизованной водой (100 мл) и окончательно буфером (100 мл). Далее суспензию вносят в хроматографическую колонку (1 р,10 см), промывают 20 мл буфера, а затем распворами с линейным градиентом концентрации ЙХ-цистеина в том жебуфереотОдо 0,1 мольВ,Е,-цистеина. Фракции, содержащие белок, объединяют, обессоливают электродиализом и высушивают лиофильно. Выход маркаптоальбумина с 5 Н-титром 1,000,02 моль ЯН-групп на 1 моль белка; 41 мг. Он не содержит остаточных липидов, димерного альбумина и альбу- мина с блокированной ЬН-группой.П р и м е р 4. Использование носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии при извлечении альдолазы из сильно разбавленного раствора.500 мл сильно разбавленного раствора (10- М) альдолазы из скелетной мышцы кролика (Боейг 1 пдег й ЯоеЬп, ФРГ) в буфере (5 М мочевина - 0,1 М Иа-фосфат - 1 мМ ЭДТЛ, рН 7,8) в течение 6 час интенсивно встряхивают при температуре 4 С с 0,5 г носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии,Твердую фазу затем отделяют фильтрованием, промывают 50 мл буфера и вносят суспензию в хроматографическую колонку (110 см), При промывании колонки линей 5 10 15 20 25 30 35 ным градиентом концентрации Р,1,-цистеина от 0 до 0,2 М раствора в том же буфере белок смывают в объеме 1,6 мл, т. е. в одну стадию раствор белка удается сконцентрировать в 312 раз. После обессоливания диализом и лиофильной сушки выход белка составляет 13,9 мг. Гомогенность полученного препарата подтверждена электрофорезом в полиакриламидном геле.П р и м е р 5. Регенерация отработанного носителя.3 г отработанного носителя, т. е. носителя, использованного в процессе дисульфиднообменной ковалентной хроматографии, суспендируют в 20 мл буфера (0,01 М Трис-НС 1 - 0,15 М Ха-додецилсульфат - 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), добавляют 0,5 мл 2-меркаптоэтанола и перемешивают 6 час при комнатной температуре. Твердую фазу отделяют, промывают буфером, а затем обрабатывают 2,2-дипиридилдисульфидом согласно методике, описанной в примере 1.Носитель для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии согласно настоящему изобретению обладает высокой механической прочностью, устойчивостью к условиям стерилизации и повышенным температурам (до 200 - 300 С), инертностью к органическим растворителям, отсутствием зависимости объема матрицы от применяемой жидкой фазы. Этот носитель не разрушается микроорганизмами, может длительное время храниться в нестерильных условиях, а после частичного срабатывания активной поверхности легко регенерируется. Формула изобретения 1. Модифицированный макропористый кремнезем, содержащий на поверхности группу ЕСН )- М 1 - СО - Н - 8 - 8Х в качестве носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии белков.2. Способ получения соединения по п. 1, отл и ч а ю щ и й с я тем, что макропорпстый кремнезем, модифицированный у-аминопропилтриэтоксисиланом, подвергают взаимодействию с 1-оксо-этокси-тиолан-оном в среде инертного органического растворителя, с последующей обработкой полученного продукта 2,2-дипиридилдисульфидом в водноорганической среде при рН 7,2 - 8,5,