Способ выделения белков и нуклеиновых кислот из их смеси

(22)Заявлено 05.06.80 (2) 2936309/30-15с присоединением заявки Рй -(51)М. Кл. А 23 д 1/18 Гасударственный камитет СССР по двлам кзебретениЯ и вткрыткЯ) Заявител а Ленина институт соединений АН ментооргаСР(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ ИХ СМЕСИ1.Изобретение относится к прикладнойбиохимии и микробиологии и касаетсяразделения белков и нуклеиновых кислот, содержащихся кэкстрактах, получаемых из объектов природного проис-хождения, в частности из растений,микроорганизмов, тканей животных, иможет быть использовано как в лабора"торной практике, так и при решенииряда практических задач, связанных сполучением очищенных белков и нуклеиновых кислот,Известен способ разделения белкови нуклеиновых кислот, основанный наразличии в распределении биополимеровв двухфазных системах. Согласно этому способу к 25-80/-ному водно-спиртовому раствору белково-нуклеиновойсмеси добавляют 1-84 ыеорганическойводорастворимой соли по отношению к20исходной смеси, При этом образуетсядвухфазная система, состоящая из вод.но-спиртовой фазы, в которой концен.,трируются белки, и водно-солевой фазы, которая содержит нуклеиновые кислоты. Этот метод позволяет получать белок с низким содержанием нуклеиновых кислот (1,8-2 Ф) без потери функциональных свойств 1 11.К недостаткам этого метода следует отнести сложность аппаратурного оформления процесса, особенно в условиях крупнотоннажного производства.Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ выделения белков и нуклеиновых кислот из их смеси путем обработки их раствора ангидридом дикарбоновой кислоты при рН 7,5 с последующим осаждением белка в изоэлектрической точке. По указанному способу обработка исходной белковонуклеиновой смеси осуществляется ангидридом дикарбоновой кислоты, в частности янтарным ангидридом, при весовом соотношении исходная смесь- ангидрид 1:1 - 1:0,4. Этот способ позволяет получать белок с высоким68,865,5.62,260,553,50,22 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 38889выходом904 низким содержаниемнуклеиновых кислот и хорошими фуннциональными свойствами21, .Недостатки этого способа заключаются в большом расходе янтарного ангидрида и недостаточно высоких фун-:кциональных свойствах получаемогобелка.Целью изобретения является улуч. шение функциональных свойств белка, 10полученного разделением белковонуклеиновой смеси.Поставленная цель достигается тем,что в качестве ангидрида дикарбоновой кислоты используют ангидрид Мацетилглутаминовой кислоты при весовом соотношении белок - ангидрид Ыацетилглутаминовой кислоты от 1:0,4,до 1:0,6.П р и м е р 1. 0,5 г белково"ну"клеиновой смеси, содержащей 0,4 г белбелка, растворяют в 25 мл 0,1 н раствора едкого натра; К полученномураствору при рН 7,5 прибавляют приперемешивании порциями 0,16 г ангидрида И-ацетилглутаминовой кислоты,выдерживают 1 ч при рН 7,5 и осаждают белок в изоэлектрической точкедобавлением 2 н НС 1. Белок отделяютцентрифугированием, промывают водой.и сушат. Из супернатанта при рН 1,030осаждают нуклеиновые кислоты добавлением 2 н НС 1, отделяют центрифугированием, промывают пропанолом, серным эфиром и сушат на воздухе.Получают 0,35 г (87,5) белка с з 5содержанием общего азота 15,0,нуклеиновых кислот 2,08 и 0,09 гнуклеиновых кислот с содержаниемосновного вещества 903. Растворимость полученного белка составляет, фмг/мл:при рН 9точке, добавляя 2 н НС 1. Белок о- деляют центрифугированием, промывают водой и сушат.Иэ супернатанта добавлением 2 н НС 1 при рН 1,0 осаждают нуклеиновые кислоты, промывают пропанолом, серным эфиром и сушат. Получают 70 г (933) белка с содержанием общего азота 14,9 Ф, нуклеиновых кислот 1,84 и 10 г нуклеиновых кислот с содержанием основного вещества 923. Растворимость полученного белка составляет, мг/мл:при рН 9,00 70,28,00 68,37,00 65,56,00 62,15,00 55,04,00 0,23Определение функциональных свойствбелков (растворимость в интервалерН 4-11, емульгирующая способность),полученных разделением белково-нуклеиновых смесей, осуществляетсяследующим образом.методика определения растворимости белков,1 г белка суспендируют в 50 млдистиллированной воды, добавляют приперемешивании 5 н раствор едкого натра до рН 12,0, выдерживают 0,5 чпри перемешивании, Затем добавлением0,2 н раствора соляной кислоты доводят рН раствора до 11,0 и отбираюталиквоту. Аналогично отбирают аликвоты при рН 9,0; 7,0; 6,0; 5,0; 4,5;4,0; 3,5; 3,0.Отобранные аликвоты центрифугируютпри 15000 об/мин в течение 40 минпри 25 С. Концентрацию белка в супернантах определяют по биуретовой реакции спектрофотометрически на приборе"Яресо 1" при длине волны 540 нм.Полученные результаты растворимости белков в зависимости от рН раствора приведены в таблице.Белок, мг/мл, полученныйпо способу3,0 0,15 0,10 4,0 0,22 0,20 28,00 1,00 П р и м е р 2. 100 г белковонуклеинового концентрата, полученно- Ьо го иэ биомассы дрожжей р. Сапй 1 йа Мцсойетща и содержащего 75 г белка, растворяют в 1,5 л 0,1 н раствора едкого натра. К полученному рас.твору прибавляют при рН 7,5 порциями ы 45 г ангидрида Х-ацетилглутаминовой кислоты, выдерживают 1 ч при рН 7,5 и осаждают белок в изоэлектрической предлагаемому известному888909 Вбу, составляет 53,7, а полученных по известному способу - 38,5.Таким образом, предложенный способ выделения белков и нуклеиновыхф кислот из белково-нуклеиновой смесипозволяет получать белок с низкимсодержанием нуклеиновых кислот 1,82,04 и хорошими функциональнымисвойствами и, в частности с высокойрастворимостью в физиологическоминтервале рН (5-9), что особенноважно для их последующего йспользова.ния, Растворимость белков, полученных по предложенному способу выше,.1 чем у белков, полученных по известному способу. Кроме того, предложенный способ дает возможность снизитьрасход ангидрида при обработке бел-.ково-нуклеиновой смеси. Продолжение тал Белок, мг/мл, полученный по способурн тее еще вееа еетепредлагаемомуизвестному 3,20 53,50 5,0 60,50 6,0 3,40 62,20 7,0 9,00 67,42 70,65 11,0 Формула изобретения Составитель В.ЗахаровРедактор Т,Веселова Техред 3. Фанта Ко ектор Л. БокшанРрЗаказ 10795/5Тираж 567 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. /5,4/5 филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,Методика определения эмульгирующей способности белков.100 г белка помещают в 50 мл М яйцевидную колбу, добавляют 10 мл дистиллированной воды и перемешивают при рН 7,0"7,5 до получения раствора или однородной суспензии.Затем добавляют 10 мл рафинирован З ного подсолнечного масла и перемешивают в течение 1 мин при 16000 об/мин. Полученную эмульсию помещают в 10 мл центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 1300 об/мин, 30Эмульгирующую способность белков рассчитывают по формуле ВАэ.с. = - сооВ У33где Э.С. - эмульгирующая способностьбелка, 3А - высота водного слоя впробирке, ммВ - полная высота эмульгируе- щвмой смеси в пробирке,мм .Эмульгирующая способность белков,полученных по предлагаемому спосоСпособ выделения белков и нуклеиновых кислот из их смеси путемобработки их раствора ангидридомдикарбоновой кислоты при рН 7,5с последующим осаждением белка визоэлектрической точке, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюулучшения. Функциональных свойствполучаемого белка, в качестве ангидрида дикарбоновой кислоты ис"пользуют ангидрид Х-ацетилглутаминовой кислоты при весовом соотношениибелок - ангидрид Х-ацетилглутаминовой кислоты от 1:0,4 до 1:0,6.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССРй 557785, кл. А 23 д 1/18, 1977.2. Патент США й 4168262,кл. 260-112 й , 1979.