Способ получения 2 -дезоксинуклеозид-5 -0-1 тиотрифосфатов

(9 Н 1920 1)5 ЕТЕН НИЕ ИЗОБ ОП СВИДЕТЕЛЬСТВУ К АВТ мщювееие Пр тио)триится к усолучения де- ифосфатов оже оло 8 К- ем ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(21) 4322727/04 (22) 29,10.87 (46) 15.11.92. Бюл. М 42 (71) Институт цитологии и генетики Со АН СССР (72) В,С.Богачев (56) Оообу В.З., заМоУ УУ. Югпре зупйез 3 апб зерагабоп о 1 Фе базтегеоаегз о 1 -1 Ыо абоодз о 1 гЬо- апб беохугйо- б- апб тгрйозрЬате. Тетгай. .ест. 1986, ч.27, В 31,р.3599-3602, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2-ДЕЗОКСИНУКЛ ЕОЗИД-О-(1-ТИО)ТРИФОСФАТОВ (57) Изобретение относится к химии нуклеозидов, в частности, к получению 2-деэоксирибонуклеозид-О-(1-тио)трифосфатов общей формулы О -Р(О)(О )-О-Р-(О)(О)ОДанное изобретение от вершенствованному способу зокси нукл еозид-О-(1-тиоОО О ОНОгде В-цитозин-ил, гуанин-ил, и мбыть использовано в молекулярной бигии и генетической инженерии,Цель изобретения - увеличение выхоцелевых продуктов и упрощение процесдостигается выявлением условий и парамеров реакций, времени, концентрации, реционной среды, присутствидополнительных реагентов. Р(5)(О )О-СН 2-СН-О-СНВ-СН-СН(ОН), где В-гуанин-или или цитозин-ил, используемых в генетической инженерии и молекулярной биологии. Цель - повышение выхода и упрощение процесса. Синтез ведут из 2- дезоксирибонуклеозидов обработкой их сначала тиохлорокисью,фосфора в смеси триметил- и триэтилфосфате (1:1) в присутствии пиридина при 0-5 ОС (110-130 мин), затем пирофосфатом в виде раствора его три-н-бутил-аммониевой соли в безводном ацетонитриле (4-10 мин) и далее водой (20- 50 мин) (гидролиз). Выделение целевых веществ ведут на ионообменных колонках. Эти условия позволяют увеличить выход целевых веществ до 85-90)ь при снижении длительности процесса и сокращении расхода тиохлорокиси фосфора. м е р 1. Дезоксигуаноэин-О-(1 сфат (ббТР,Я), тетралитиевая соль. Дезоксигуанозин (10,7 мг, 40 мкмоль), высушивают при 110 С, 12 мм рт,ст. надъ 4 Р 205 в течение 8 ч, растворяют при переме- ц шивании и нагревании до 120 С в течение 1 р мин в смеси триэтилфосфат-триметилфосфат(1:1,0,18 мл), охлаждаютдо 25 С, прибавляют пиридин (6,6 мкл, 82 мкмоль), О" охлаждают в ледяной бане до.0 С, прибавляют сеежеперегненную РЯСэ г 8 мкп, 80 мкмоль), еыдержиееют при етои же темпе- ь ратуре 120 мин. Затем к реакционной смеси добавляют раствор ди-(три-н-бутиламмониевой) соли пирофосфатной кислоты (66 мг, 120 мкмоль) в безводном ацетонитриле (0,6 мл), содержащий также три-н-бутиламин (22 мкл,90 мкмоль), встряхивают, выдерживают раствор и ри комнатной температуре 10 мин, прибавляют воду (". мл), выдерживают еще1775406 43,12 и 42,82 (д), Р -22,67 (дд), Р 5,94 м.д. (д)Таким образом, данный способ позволяет примерно в 2 раза повысить выход целевых продуктов (85-90) при упрощении процесса за счет применения меньшего количества реагента (РЗО) и меньшей продолжительности стадий.Формула изобретения Способ получения 2-дезоксинуклеозид -О-(1-тио)трифосфатов общей формулы 1 45 мин и наносят на колонку с ДЗАЭ-сефадексом А(7 0,9 см, НСО з). Колонку элюируют водой (20 мл) и затем линейным градиентом 0,10 - 1,0 М бикарбоната аммония, рН 8,5 по 50 мл в смесителе и резерву аре, Продукт выходит при концентрации соли 0,70-0,75 М (425 о.е.260, 90 от теоретического выхода). Воду упаривают в вакууме, бикарбонат аммония удаляют многократным упариванием с 60 спиртом 10 в вакууме. Остаток растворяют в воде (5 мл), титруют раствором 0,1 М гидроокиси лития до рН 8,5, пропускают раствор через колонку (2 0,8 см), содержащую в нижней части 1 мл Спеех 100(О), а в верхней Дауэкс 50 2 15 (О+, 1 мл). Продукт элюируют водой (20 мл), раствор упаривают в вакууме до обьема 0,1 мл и прибавляют 1,5 мл 0,5-ного перхлората лития в ацетоне. Осадок центрифугируют, промывают ацетоном (2 1 мл), эфиром (1 20 мл) и высушивают в вакууме над Р 20 э при 25. УФ-спектр А гййх (я) 253 нс (13700), Л й 11 й (е) (232 нм (4800), 31 Р-ЯМР-спектр: ф, 43,32 и 42,84 (д), ф -22,72 (дд), Р -5,93 м,д, (д) 25П р и м е р 2. Дезоксицитидин-О-(1- тио)трифосфат(бСТР,З) тетралитиевая соль. Дезоксицитидин (9,2 мг, 40 мкмоль) тиофосфорилируют и обрабатывают пирофосфатом так же, как описано в примере 1. 30 Получают 309 о.е,272 (85) продукта в виде смеси диастереомеров, Осаждение его в виде тетралитиевой соли дает 16,4 мг.УФ-спектр: А ПИХ (е) 272 нм (9100), А П 33 П (е) 250 нм (6300); з Р-ЯМР-спектР:Рк 35Г О О Ь В 0-Р-О-Р-Р 0 О 0 0 НОгде В-гуанин 9-ил- или цитозин-ил, путем обработки 2-дезоксинуклеозидовтиохлорокисью фосфора в триалкилфосфате в присутствии основания при температуре 0-5 С с последующим добавлением раствора пирофосфата и гидролизом реакционной смеси, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и упрощения процесса, обработку дезоксинуклеозидов тиохлорокисыо фосфора проводят в смеси триэтилфосфата и триметилфосфата (1;1) в присутствии пиридина в течение 110- 130 мин, пирофосфат добавляют в виде раствора его три-н-бутиламмониевой соли в ацетонитриле и выдерживают в течение 4- 10 мин, а гидролиз реакционной смеси осуществляют водой в течение 20-80 мин. Составитель Г.КонноваТехред М,Моргентал Редактор . Корректор Н.Бучок Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 40/9 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5