Способ получения 2 -дезоксинуклеозид-5 -0-(1-тио) трифосфатов

СООЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИ 1775 ЕСПУБЛИК 9) 07 Н 19(5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР с. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ К АВТОРСКОМ ЕТЕЛЬСТВ0Р-Р-О-Р1он-ил, и может кой инженеение выхода ие процесса, овий и параентов, реак- исутствием(71) Институт цитологии и генетики СО АНСССР(57) Изобретение относится к химии нуклеозидов, в частности к получению 2-дезоксирибонуклеозид-0-(1-тио)трифосфатовобщей формулы 0 -Р(0)(0)-0-Р(0)(0 )-0 Изобретение относится к усовершенствованному способу получения 2-дезоксинуклеозид-0-(1-тио)трифосфатов общей формулы 1 где В-аденин-ил- или тимин- быть использовано в генетиче рии и молекулярной биологии.Цель изобретения - увели целевых продуктов и упрощен - достигается. выявлением усл метров реакций: времени, реа ционной среды, пр дополнительных реагентов. 2Р(Я)(0 )-0-СН 2-СН-СН В-СН 2-СН(ОН, где В-аденин-ил или тимин-ил, используемых в генетической инженерии и молекулярной биологии, Цель - повышение выхода и упрощение процесса. Синтез ведут из 2-де-зоксирибонуклеозидов последовательной обработкой их тиохлорокисью фосфора в тризтилфосфате в присутствии пиридина при 0-50 С 10-45 мин, раствором трибутиламмония тетрафосфата в ацетонитриле (4- 10 мин) и водой (15-20 мин) с последующим выделением целевых веществ на ионнообменных колонках. Выход,. Ж: брутто-ф-ла, а) 92; С 1 оН 1 з 148201 з РзЯ б) 92, С 9 Н 1 Ю 4 ИБО 11 РзЯ. Способ позволяет повысить выход. более чем вдвое, при уменьшении времени синтеза и расхода реагентов,П р и м е р 1. 2-Дезоксиаденоэин-0-(1-тио)трифосфат (АТВгЯ), тетралитиевая соль. Дезоксиаденоэин 10 мг (40 мкмоль), высушенный при 110 С, 12 мм рт.ст, над Р 205 в течение 8 ч, растворяют при перемешивании и нагревании до 110 С (1 мин) в 0,16 мл ТЭФ, охлаждают до"25 С, прибавляют пиридин (6,6 мкл, 82 мкмоль), охлаждают до 0 С, прибавляют свежеперегнанную РЯСз (4,5 мкл, 45 мкмоль), встряхивают и выдерживают 10 мин при 0 С. Затем к реакционной смеси добавляют раствор пирофосфата три-н-бутиламмония (66 мг, 120 мкмоль) в безводном ацетонитриле (0.6 мл), содержащем три-н-бутиламин (22 мкл, 90 мкмоль), встряхивают, выдерживают раствор при температуре 25 фС в течение 10 мин, прибавляют 2 мл воды, выдерживают 45 мин и раствор наносят на колонку (0,9 71775405 О О ЬОБ0-Р-О-Р-О-Р-О201он Составитель Г.КонноваТехред М.МоргенталКорректор Н,Бучок Редактор А.Пичина Заказ 4 Й 9 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 ланку элюируют водой(20 мл) и затем линейным градиентом 0,1-1,0 М МН 4 НСОз (рН 8,5), 100 мл. Продукт элюируется при концентрации соли 0,70-0,75 М 560 о,е,260 (92). После упаривания воды и удаления МН 4 НСОз в вакууме остаток растворяют в воде (5 мл),.титруют раствор 0,1 М 1 ОН до рН 8,5, пропускают через колонку(0,8 2 см, содержащую в нижней части смолу СЬеех 100 (. ) (1 мл), а в верхней - Дауэкс 50 Я 2( , 1 мл), элюируют продукт водой (20 мл), раствор упаривают в вакууме до объема 0,1 мл и продукт осаждают 0,5-ным растворомСО в ацетоне (ОСЧ, 1,5 мл). Осадок центрифугируют, промывают ацетоном (2 1 мл), эфиром (11 мл) и высушивают в вакууме над Р 20 ь. Получают 20 мг бесцветного порошка тетралитиевой соли хАТ 8. ЗНгО. Продукт гомогенен при высокоэффективной хроматографии насЬгозогЫЧН 2 б 5 мкм в градиенте 0 - 0,3 М фосфат калия (рН 6,5) в 307 ь-ном водном ацетонитриле, дает два равных по площади пика Вр и Яр-диастереоизомеров при обращенно-фазовой хроматографии на йцсеоз 1 С 18, 5 мкм в градиенте 0-40 водный метанол, 0,05 МС 04, 0,02 М,ОАс (рН 5,0) УФ-спектр (Н 20, рН 7, Зресогб ОЧЧ 3, ГДР): Л щах(е) 259 нм (1 5200), Л илй (е) 230 нм (4700). 31 РЯМР-спектр (прибор ВгоКег НХ, частота 36,43 МГц, внешний стандарт 85; НЗРО 4, Д 20/ЭДТА, рН 8,5, 30 С, м.д.): Р, 43,30(д) и 42,80(д); Рр -22,71(ДД), Р -5,92(д),П р и м е р 2. 2-Дезокситимидин-0-(1-тио)-трифосфатТТВЯ),тетралитиевая соль. Дезокситимидин (9,6 мг, 40 мкмоль), после осушки растворяют в 0,08 мл ТЭФ (100 С, 0,5 мин), охлаждают до 25 С, прибавляют пиридин (6,6 мкл, 83 мкмоль), охлаждаютдо 0 С, добавляют свежеперегнанную РЯС (4,5 Мкл, 45 мкмоль) и выдерживают при той же температуре 45 5 мин. Далее обработку, выделение и идентификацию продукта проводят, как описано в примере 1. Выход ТТР 368 о.е.267 (96).Осаждением (см. выше) получено 18 мг тетралитиевой соли.10 Таким образом, выход по данному способу повышается более, чем в 2 раза при уменьшении (примерно четырехкратном) продолжительности процесса,Формула изобретения 15 Способ получения 2-дезоксинуклеоэид 5-О-(1-тио)трифосфатов общей формулы где В-аденин-ил- или тимин-ил, путем 25 обработки деэоксинуклеозидов тиохлорокисью фосфора в триэтилфосфате в присутствии основания при температуре 0-5 С с последующим добавлением раствора пирофосфата и гидролизом реакционной смеси, 30 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюувеличения выхода целевого продукта, и упрощения процесса, обработку дезоксинуклеозидов тиохлорокисью фосфора проводят в присутствии пиридина в течение 10 - 45 35 мин, пирофосфат добавляют в виде раствора его три-н-бутиламмониевой соли в ацетонитриле и выдерживают 4 - 10 мин, а гидролиз реакционной смеси осуществляют водой в течение 15 - 50 мин.