Способ идентификации вирусов и бактерий

КП Т ИРУС ФИКАЦ 9.82) тносится к генн ации нуклеинов У кацетения дентиф лючает е проб щени вирум ств- нит- реая осуым1125 нанесен еченным 6(р 3 СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ОПИСАНИЕ(72) Туула Марьют Ранкии Ханс Эрик Седерлунд (Е 1)(54) СПОСОБ ИДЕНТ И БАКТЕРИЙ (57) Изобретение инженерии и касае тификации вирусов щью сэндвич-гибри кислот. Цель изоб способа. Способ и сов и бактерий за что контактирован ют с реагентом,целлюлозу, и снтом. 6 табл,ся способа иден- и бактерий с пом(2 10" молекул).УФДНК зобной железы теленка,1,088 мкг.фф Холостое испытание (отсутствие ДНК) Составитель Н. КузенковаРедактор Н. Киштулинец Техред М.Ходанич Корректор М. Демчик Заказ 1426/57 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/51386031 1 О Изобретение относится к генной инженерии и касается способа идентификации вирусов и бактерий с помощью сэндвич-гибридизации нуклеиновых кис 5 лот.Цель изобретения - упрощение способа,Упрощение способа обеспечивается за счет того, что контактирование пробы осуществляют одновременно с реагентом нанесенным на нитроцеллюлозу, и с меченным 1 реагентом.2 Способ подтверждается следующими 15примерами.П р и м е р 1, Реагенты.Выращивают аденовирус типа 2(АТССЧВиз КТЬ, т,е, Мат,2.опа 1 РцЫ 2.еНеа 1 т,1 т Жтя 12.Стет.е Хальсинки), очищают 20и выделяют ДНК далее будет называться Ай -ДНК) ДНК, переваривают сВаптН 1-ограничительным ферментом начетыре фрагмента., Из этих четырехфрагментом два клонируют в ВашН 1 сацш 25вектора рВВ 322 (ВВЬ), Затем бактериальный хозяин (К.со 12. НВ 101 (К 12)да 1 , рго , 1 еп , пгя-, 1 тгш, гесА,яраг, 1" (полученный из КТЬ) трансформируют полученной плазмидной смесью. 30Из числа трансформированных бактериальных клонов выбирают те, которыенаиболее вероятно содержат рекомбинантную плазмидную ДНК, а именностойкие к ампициллину и тетрациклину клоны. Однако бактерии, содержащиерекомбинантную плазмидную ДНК, чувствительны к тетрациклину, посколькусаишВашН 1 находится в пределах тетрациклинового гена, и введение инородной ДНК в эту зону разрушает ген.Клоны, содержащие плазмиды, Ай 2 СрВВ 322, КТЬ В Е 231 и А 62 Р-рВВ 322,КТЬ-ЕН 230, выращивают и очищают. Рекомбинантную плазмиду Ай Р-рВВ 322 45используют в качестве фильтра-реагента. Согласно изобретения нет необходимости удалять плазмидную последовательность, поскольку данная проба не содержит последовательностирВВ 322. Для радиоактивного мечениянуклеиновую кислоту отделяют отрВВ 322-ДНК после вываривания с ВашН 1посредством электрофореза агарозного,тела. С-фрагмент выделяют из ЬСТ-агарозы посредством экстракции феноломили электроэлюирования и концентрируют путем осаждения этанолом,Фиксация ДНК на Фильтре. 2Рекомбинантную плазмиду АйдРрВВ 322 денатурируют до одноцепнойФормы и обрабатывают 0,2 н. ИаОН(5 мин, 100 С), после чего ДНК охлаждают, перед переносом на фильтр нейтрализуют и вводят пипеткой в раствор,среда 4 фББС на льду (ББС=0,15 М ИаС 1,0,015 М цитрат натрия). Фильтры(БсЫе 2.с 1 тег и Б 1 т 2.Ш ВА 85 нитроцеллюлоза), тщательно смачивают в растворе 4"ББС (примерно 2 ч) до ввода ДНК.ДНК фиксируют на фильтре в разбавленном растворе (0,5-1,0 мкг/мл) путемвсасывания этого раствора черезфильтр при слабом вакууме, Этотфильтр способен поглощать ДНК вплотьдо 80 мкг/см , Используют концентра-:2ции ДНК в пределах от 0,5 мкг ДНК//2,5 см диаметра фильтра до 1,0 мкг//ДНК/0,7 см диаметра фильтра. Послефильтрации ДНК фильтры промывают в4"ББС, высушивают при комнатной температуре и прокаливают в вакуумнойпечи при 80 С в течение 2 ч.Мечение радиоактивного фрагментануклеиновой кислоты,Используемым для мечения радиоактивным индикатором является изотоп1 , Этот изотоп детектируют с ис 125пользованием -счетчиков, которыенаиболее доступны для лабораторныхприменений. Период полураспада этогоизотопа составляет 60 дней, в результате чего срок использования меченыхИ1 реагентов составляет примерно4 мес.Мечение путем ИсК-трансляции,В данной реакции ДНК становитсярадиоактивно меченой, когда растворсодержит меченую изотопом 1 дезоксинуклеозидную трифосфатазу (ОСТР)в качестве субстрата, в данном случае называемую 125,-6-СТР (радиоактивный центр, Амершам; 1500 С 2./ммоль),При оптимальных условиях может бытьдостигнута удельная активностьО отсч/мин/мкг ДНК. Меченую ДНКочищают от нуклеотидов, оставшихсяв реакционной смеси, путем простойгель-фильтрации, например путемиспользования Биогеля Р 30 (Биорадиактивного). Другие способы мечения,Реагент (одноцепная нуклеиновая кислота, продуцированная М 3 шр-Фагом) подвергают мечению путем химического иодирования, в котром актнвный 1ковалентно связан с нуклеиновой кислотой.В случае РНК-содержащего вирусаклонирование фрагментов генома осуще-ствляют таким образом, что сначалаполучается воспроизводимая копия ДНК(с ДНК) вируса РНК посредством обратной транскриптазы, а затем посредством ДНК-полимераэы воспроизводитсявторая цепь ДНК.Проведение испытания,Обработка пробы.Микробную нуклеиновую кислоту,подвергаемую исследованию, выделяют 5из самого микроба, а также из зараженных клеток, после чего ее денатурируют до одноцепной формы. Вырусныегеномы высвобождают путем обработкиматериала пробы 7-ным додецилсульфатом натрия (ЯРБ) и разрушают белки,защищающие посредством К-обработкипротеиназой (1 мг/мл, 37 ОС, 60 мин).Кроме того, бактериальные пробы разрушают с использованием обработки 25лизоцимом и этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЕДТА).Если проба содержит большие количества вязкой высокомолекулярной кпеточной ДНК, то с целью уменьшениявязкости этой пробы воздействуютультразвуком или путем продавливанияпробы несколько раэ через .тонкое отверстие.Гибридизация.Гибридизацию осуществляют, например, в 507.-ном формамиде (деионизированный, выдержанный при - 20 С)в 4 ББС, раствор 1 х ВепЬаг 6 С, содержащий Х БОБ и 0,5 мг/мл ДНК (лососевая 40сперма или зобная железа теленка),опри 37 С и обычно в течение ночи (1620 ч), Выбранные для испытания фильтры термостатируют в соответствующемсосуде, в который вводится смесь гибридизации, и начинается гибридизация.Эта смесь гибридизации содержит предварительно обработанную пробу, в ко"торую вводится радиоактивная нуклеиновая кислота (или кислоты) в качестве реагента, которая денатурирова 50на совместно с этой пробой путем кипячения в течение 5 мин с последующим быстрым охлаждением при 0 С;концентрированные растворы формамида,ББС и РепЬагй 1, которые вводят пипеткой в денатурированную и охлажденную смесь нуклеиновых кислот. Послесмешивания смесь гибридизации вводят пипеткой на фильтры в сосуде гибридизации. После гибридизации фильтрыосторожно промывают и в отдельностиподвергают замеру в р-счетчике,Детектирование аденовируса методомсэндвич-гибридизации (табл. 1),Среду гибридизации измеряют в испытательной пробирке, содержащей лишьфильтр и меченую нуклеиновую кислоту .в качестве реагента, без пробы. Средугибридизации создают последовательностями рВБ 322, находящимися в меченой нуклеиновой кислоте (реагента),Эти последовательности гибридизируютнепосредственно с Фильтром без участия пробы. Фильтры, содержащие зобную железу теленка и не содержащиеДНК, используют в данном испытаниикак контрольные, показывая, на специфичность гибридизации и на уровеньнеспецифической среды, создаваемой,например, при недостаточной промывке.В табл. 1 среду, обусловленнуюреагентами, отделяют от срш, гибридизированных с фильтрами,Меченая нуклеиновая кислота в качестве реагента.Ай -ВвлН 1, С - фрагмент, очищенный, удельная активность 90 10 отсч//мин/мкг (200000 отсч/мин 1/реакция).Гибридизация; 507.-ный формамид,4 БЯС. Раствор 1)епЬагй, содержащий0,5 мг/мл ДНК спермы лосося и Е ЯРЯ,37 С, 16 ч.Промывка: 0,17. ЯБС, комнатнаятемпература, 40 мин.Пробы: ДНК Аденовируса типа 2(ВБЬ).Заражают аденовирусом типа 2 клетки НеЬа, Эти клетки затем разрушаютпутем обработки 1 Е ЯОБ с последующимвывариванием 1 мг/мл протеиназы-КФермента (сигма) в течение 30 минопри 37 С. Перед денатурированием пробу пропускают через тонкое отверстие.Значения, приведенные в табл. 1, были рассчитаны путем выделения средыреагента, полученной при осуществлении аналогичной гибридизации, но безпробы.П р и м е р 2. Детектирование РНКвируса посредством сэндвич-гибридизации (табл. 2).Используют модель РНК-вируса, аименно штамм Яеш 3.Же-вогез (прототипный штамм, полученный в Лондонской школе гигиены и местной медициФны), который является одноцепочнойРНК. Получают ДНК, которую клонируютв точку Ря 11 плазмида рВВ 322. Получают рекомбинантную плаэмиду рКТН 312КТЬ Ф ЕН 232. Клон бактерий, содержа 5щих эту плазмиду, имеет длину, составляющую примерно 1400 нуклеотидовсо структурной белковой частью, примерно от нуклеотида 200 до нуклеотида 1600, когда нумерация ведется отначала структурных гейов. Для продуцирования реагентов рекомбинантнуюплазмидную ДНК рКТН 312 обрабатываютс ограничительным ферментом ЕсоВ 1(ВВЬ) (последовательность, происходящая от вируса Беш 1 Же Рогея 1, не содержит. точек распознавания для фермента ЕсоВ 1), и эту линейно вытянутую плазмиду разделяют на два фермента с использованием фермента ХЬо 1(ВВЬ), Точка распознавания последнего расположена внутри вирусной последовательности Беш 3.аде-Рогея 1.Фрагмент А ЕсоВ 1-ХЬо 1 большего разме ра (примерно 3900 основных пар) фиксируют на фильтре, и фрагмент В меньшего размера (примерно 1850 основныхпар) подвергают мечению изотопом1с использованием метода "ник"30трансляции. В данном испытании используют как свободный вирус Беш 1 ИеРогея 1, так и зараженные вирусомклетки. В обоих случаях специфические нуклеиновые кислоты вируса данной пробы состоят полностью из РНК.35Меченные нуклеиновые кислоты вкачестве реагентов ЕсоВ 1-Хйо 1 - фрагмент В плазмида рКТН 312, удельнаяактивность 90 10 отсч/мкг ДНК(200000 отсч/мин 1реакция).Гибридизация. Как описано в:табл. 1.Промывка. Как описано в табл, 1.Пробы. До проведения испытаниявирус Беш 3.Же-Рогея 1 (30 мкг) разрушают посредством БОБ. Зараженныеклетки подвергают обработке, как указано в табл. 1. Заражение вирусомБеппо.Ые-Уогея 1 осуществляют на клетках ВНК,Данные, приведенные в табл. 2,рассчитывают с учетом среды реагента,полученной при аналогичной гибридизации, без пробы.П р и м е р 3. Проба вируса, в которой вирусный передатчик РНК детектируется посредством метода сзндвичгибридизации (табл. 3). Реагенты сэндвич-гибридизации получают иэ ДНК вируса БЧ 40 (ВВЬ) путем разделения ДНК на две части с использованием РяС 1-фермента. Эти фрагменты выделяют и очищают посред-. ством электрофореза на агарозном геле. Фрагмент А (4000 основных пар) подвергают радиоактивному мечению путем "ник" трансляции 1 " и фрагментыВ (1220 основных пар) фиксируют на фильтре;Фрагменты.ДНК выбирают таким образом, что каждый содержит гены, кодирующие как ранние, так и поздние передатчики инфекции. Так, например, фрагмент В содержит примерно 700 основных пар от структурного белкового гена ЧР 1 и более 600 основных пар от гена более ранних передатчиков инфекции. Поскольку ДНК вируса ЯЧ 40 сама по себе представляет собой кольцо с ковалентной связью, то она не может быть детектирована в данном испытании до линейного выравнивания. Следовательно, при использовании зараженных клеток в качестве пробы можно проверить, насколько предлагаемый способ пригоден для детектирования воспроизведенных молекул РНК вирусного генома. Как видно из результатов, приведенных в табл, 3, данное испытание пригодно для исследования зараенных клеток. В табл. 3 также показано, что одни и те же реагенты используют для исследования как вирусной ДНК, так и полученной из нее ш РНК (информационной РНК),Меченая нуклеиновая кислота, используемая в качестве реагента.Более длинный А-фрагмент Ря 1 ДНК вируса БЧ 40, удельная активность 28 10 отсч/мкг ДНК (200000 отсч/мин 1 реакция).пГибридизация. Как описано в табл. 1. Продолжительность гибридизации 40 ч.Промывка. Как описано в табл. 1,Пробы. Для вируса БЧ(ВВЬ) обрабатывают ограничительным ферментом ЕсоВ 1 (ВВЬ). Клетки С Ч 1 заражают вирусом БЧ 40 и собирают через 40 ч после заражения, Обработка пробы осуществляется как описано в табл, .Данные рассчитаны с учетом среды реагента, полученной при аналогичной гибридизации, осуществляемой без пробы.П р и м е р 4. Детектирование Вас 11 ця ашу 1 о 1 ццеГасхепя посредством сэндвич-гибридизации.Данные реагенты представляют со 5 бой фрагменты а 1-амилазного гена В.ашу 1 о 11 цеГасепя Е, 18, которые выделяют для данного испытания из рекомбинантной плазмиды рКТН 10 путем обработки ограничительным ферментом 10 и последующего электрофореза агарозного геля. Фрагменты, используемые для данного испытания, представляют собой фрагментные участки С 1 а-ЕсоК 1 о-амилазного гена (460 основных пар) . (С 1 а Воейгпяег МаппЬехт) и фрагмент ЕсоК 1 ВазпНЕ (1500 основных пар). Фрагмент ЕсоК 1-ВапН 1 фиксируют на фильтре, и фрагмент С 1 а 1-ЕсоК 1 подвергают радиоактивному мечению 20 изотопом 1методом "ник" трансляции.Как видно из табл. 4, В.ашу 1 о 1- с 1 цеГасепя в пробе идентифицируется путем сэндвич-гибридизации на основе 25 одного -амилазного гена. Е.со 1 дает отрицательный результат в данном испытании (неотличим от среды). Меченая нуклеиновая кислота в качестве реагента.Фрагмент СТа 1-ЕсоК 1 И-амилазного гена от плазмиды рКТН 10, удельная активность 35 10 отсч/мин/мкг4(200000 отсч/мин 1 /реакция).Гибридизация. Как описано в табл.1.Промывка. Как описано в табл. 1,Пробы., Бактериальные пробы обрабатывают лизоцимом (67 мкг/мл) в тече-, ние 30 мин при 37 С; в пробы Е.со 11 40 вводят также 5 ммоль ЕДТА. После такой обработки во все пробы вводят ЯРЯ (до конечной концентрации 27), затем их дважды пропускают через очень тонкое отверстие с целью сниже ния вязкости, после чего их подвергают денатурированию путем кипячения, как описано в тексте, относящемся к обработке проб.Данные, приведенные в табл. 4, рассчитаны с учетом среды реагента, полученной при аналогичной гибридизации без пробы.П р и м е р 5. Пример получения системы комбинаций реагента на основе метода сэндвич-гибридизации55 (табл. 5).Пробы, исследуемые в данном испытании, представляют собой клетки,зараженные тремя вирусами (аденовирус, вирус ЯЧ 40 и тетраплоидный вирус Негрея, имеющий лишь один определенный детерминантный ген), и пробу, содержащую бактерии Вас 11 ця ашу 1 о 1 ццеГагсця. В каждую пробу вводят одновременно следующие реагенты: пять фильтров, каждый из которых содержит один тип ДНК от вируса ЯЧ 40, аденовируса, Ы-амилазного гена Вас 11 ця алу 1 о 11 цеГагсця и зобной железы теленка, а также фильтр, не содержащий ДНК; кроме того, вводят 200000 отсч/мин каждого из следующих меченых нуклеиновокислотных реагентов: ДНК - реагент вируса ЯЧ 40, аденовируса и -амилазного гена.Данный пример показывает, что можно без разделения разбавленного раствора пробы исследовать одновременно соответствующие серии микробов путем ввода в пробу комбинации реа- гентов. Такая проба может содержать как вирусную, так и бактериальную нуклеиновую кислоту. Данные фильтры могут быть помечены определенным обозначением (марка, метка), которая определяет содержание в них реагентов и какой микроб фиксирован (гибридизирован) с ними. Эта метка может быть представлена в виде цифр или букв, например 1 или ЯЧ 40 2 или Ай и т.д., или могут быть приняты другие обозначения, напримердля ЯЧ 40 или Л для АП или 0 для Вас 3.11 ця,Меченые нуклеинокислотные реагенты, Вирус ЯЧ 40 как и в табл. 3. Аденовирус как и в табл,1,-амилазный ген как и в табл, 4,Гибридизация, Как в табл.1.Промывка. Как в табл 1,Пробы. Клеточные пробы, зараженные вирусом ЯЧ 40 и аденовирусом,были описаны соответственно в табл.3и 1.Клетки Чего 10 заражают вирусом Негрея (тетраплоидом, имеющим лишь один определенный детерминантный ген) типа 1. Клетки собирают через 20 ч после заражения, поскольку может иметь место фагоцитарный эффект. Пробу обрабатывают таким же образом, как описано для клеток, зараженных аденовирусом (табл, 1).при концентрации 7 ммоль МаОН, при 100 С, 5 мин.Клетки обрабатывают лизоцимом (500 мкг/мл), ЕДТА (70 ммоль, 37 С, 30 мин), Я 13 Б (0,257., 65 С) и свободную ДНК денатурируют путем кипячения при концентрации ИаОН 4 ммоль, при 100 С, 5 мин.Данные; представленные в табл. 6, откорректированы на среду реагента, полученную при аналогичной гибридизации, без пробы. Способ идентификации вирусов ибактерий, основанный на сэндвичгибридизации нуклеиновых кислот,включающий последовательное контактирование пробы нуклеиновой кислотыс нуклеиново-кислотным реагентом,нанесенным на твердый носитель, имеченым нуклеиново-кислотным реагентом, с последующим радиоактивныманализом, отличающийсятем, что, с целью упрощения способа,контактирование пробы осуществляютодновременно с реагентом, нанесеннымна твердый носитель, с последующейпромывкой полученного гибрида, приэтом для идентификации аденовирусовв качестве реагента, нанесенного натвердый носитель, используют АЙ 1рВВ 322 размером 47000 п.о а в качестве меченого реагента-фрагментАй ВашН 1 размером 6200 п.о., дляидентификации вируса Яеш 3.Же-ГогеяСфрагмент ЕсоВ 1-ХИо 1 размером 3900 п.оплазмиды рКТН 312 и фрагмент ЕсоН 1- ХЬо 1 плазмиды рКТН 312 размером850 п.о для идентификации вирусаБЧ 40-Ря 1 - фрагмент вируса ЯЧ 40размером 1220 п,о., для идеитификации бактерий ВасШця ашу 1 о 1 щцеГасдепя - фрагменты ЕсоВ 1-ВашН 1 плазмиды рКТН 10 размером 1500 п.о, и С 1 а 1- ЕсоВ 1 плазмиды рКТН 10 размером4600 п.о., для идентификации ЕясйегдсЬю со 1 д - плазмиду рКТН 45 размером 740 п.о. и рекомбинантный фагшКТН 207 размером 1700 п.о., дляодновременной идентификации аденовирусов, БЧ 40, Мш 3.Ие-РогеяС, Вашу 1 о 1 нцеГасепя и Е.со 1 используют все описанные выше реагенты одно- временно Меченые нуклеинокислотяые реагенты ш КТН 1207, удельная активность 8 10 отсч/мин/мкг ДНК (200000 отсч/ /мин/реакция).Гибридизация. 4 БСЯ раствор 1 ЭепЬагЫ без ВБА (альбумин бычьей сыворотки, 0,257 ЯРЯ 200 мкг/мл ДНК спермы Неггпд 17,5 ч 65 С.Промывка. Как описано в табл. 1.Пробы. ДНК клеток Е.со 11 К 12 НВ 101 выделяют, ДНК денатурнруют 9 138603 1 ОПроба Вас 11 ця ашу 1 о 1 щцеГасепя.Как в табл. 4.Данные, приведенные в табл. 5,рассчитаны с учетом среды реагента,полученной при осуществлении аналогичной гибридизации без пробы.П р и м е р 6. ДетектированиеЕясйегсМа со 1 путем сэндвич-гибридизации (табл. 6), ОРеагенты получают из ошр-А-гена(А - ген наружного мембранного белка)ЕясЬегхсйа со 13Гибридные плазмиды рКТН 40 ирКТН 45, используемые в качестве ис ф о р м у л а и з о б р е т е н и яходного материала, приготавливаютиэ плазмиды рТУ 100,Плазмиду рКТН 45 ( находящуюся нахранении как КТЬ, в институте Ба 1 хо, па 1 РцЫ 1 с Неа 11 Ь Хельсинки, под номером ЕМ 254) используемую в качестве фильтра-реагента, состоит из 7401основных пар от 5 -концевого звенагена ошрА, введенного в плазмидрВВ 322, 25Плазмида рКТН 40 содержит 300 основных пар от 3 -концевого звена гена ошрА, после чего следует 1400 основных пар от генома Е.со 1. Плазми.ду рКТН 40 расщепляют ограничительнымферментом ВашН 1 до получения фрагмента ДНК Е.со 11, который содержит1700 основных пар, как указано выпее.Этот фрагмент переносят в одноцепнойбактериофаг М 13 шр 7. Рекомбинантныйфаг КТН 1207 (обозначаемый как КТЬУ ЕН 256) подвергают мечению изотопом1 и используют в качестве индиЯ 5"катора в способе сэндвич-гибридиза 40ДНК от разрушенных клеток Е.со 1,а также выделенная и очищенная ДНКот клеток Е.со 1 детектируют посредством сэндвич-гибридизации, как показано в табл. 6451386031 ТаблицаИспытание с аденовирусом Проба Аденоф Зобная Холосжелеза тое истеленка" ф пытаВФние 2-ДНК аденовирусноготипа (ВЯЬ)(ВоеЬчпдег Мапйепа),ФуХолостое испытание (отсутствиеДНК).Т а б л и ц а 2 Детектирование вируса БешЗ.Ие-Рогея 1 посредством метода сэндвичгибридизации Проба Зобная железа ХолосВирусБеппо.з.ЕеРогея 1 ф тое испытание" телен ка Вирус Бещ 1 Же-Рогея 130 мкг 3340 33 2698 О Незараженные клетки 1 Офрагмент А ЕсоВ 1-ХЬо 1 (1,2 мкг)плазмиды рКТН 312.ДНК зобной железы теленка, 1 мкг.4 13 138 б 031 Таблица 4 Бактериальная диагностика посредством сэндвич-гибридизации Таблица 3 Детектирование вируса БЧ 40 посредством сэндвич-гибридизации Проба Проба с(-амилаэа Зобная желез а Холостое исжелезателенка+ тое испыта ниефф теленка пытание ф Испытание 1 5773 47 200 б 1 159 Беэ пробы Беэ пробыИспытание 2 Е.со 11 НВ 10125 (10 ) Клетки С Ч 1, зараженные вирусом БЧ 40, черз 40 ч после заражения (10 клеток) 30 3377 30814 294 580 ВасП 1 цяашу 1 о 1. -оцеГаг-,сця (10 ) Незараженные клетки35 2871 ФБолее короткий фрагмент РяФ В(0,2 мкг) ДНК кольцевого вируса;БЧ, вываренный с РяС 1 - ограничительным ферментом 40 %ДНК эобной железы теленка, 1 мкг. ФФФХолостое испытание (отсутствие ДНК) ЕсоВ 1-ВашН 1 фрагмент о-амилазного гена из плаэмиды РКТН 10,0,35 мкг..ДНК зобной железы теленка,мкг.Холостое испытание (без ДНК), 3 ЮФ ВируснаяДНК БЧ 40(50 нг),вытянутаяв линию А5 Фильтры (срш), отсч/мин БЧ 40" Зобная ХолосДНК плазрКТН 10обна елез олосое истелен" ка + пытание к к+ Как описа Как и вно в таблтабл. 1. абл. 4,й железы спытани ц а 6 фильтры (отсч/мин) срш об шр А бная леэа олостойопыт м теленка ДНК от Е.со 1 К 12 НВ 101а) 21 28 ДНК от Е.со 1 К 2НВ 101а) 2 -10 206 Клетки, зараженные вирусом ЬЧ 40 Клетки, эараенные аденовирусом типа2 (6 10) Клетки, зараженные вирусом Негрез