Способ получения человеческого эритропоэтина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19) 111) 1801 51)5 С 12 К 15/27 ЗО ЕН 03.12.8 ут, Инк (ОЯ) ), Родни М, Хьювик (ОЯ) А 61 К 37/24, 1983, ИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОные, кло- его иров ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНГО ЭРИТРОПОЭТИНА Изобретение относится к генетическои инженерии и касается получения рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих гены эритропоэтина человека, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии указанных генов и получения 1 и ч 1 го активного человеческого эритропоэтина.Целью изобретения является повышение активности эритропоэтина,Способ, описанный в данной заявке, раскрывает массовое производство белков, проявляющих биологическую активность человеческого ЭПО. При этом возможно получать белки, которые химически отличаются от аутентичного человеческого ЭПО, но проявляют свойства характерные для него и в некоторых случаях даже улучшенНастоящее изобретение касается н ания гена, кодирующего ЭПО, и(57) Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих гены эритропоэтина, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии указанных генов, и получения )и чтго активного человеческого эритропоэтина. Целью изобретения является повышение активности эритропоэтина. Способ состоит в том, что осуществляют получение геномного ДНК клона эритропоэтина человека гибридацией с зондами и его выделение, конструирование рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих ЭПО человека, с последующей трансформацией полученными ДНК штаммов клеток млекопитающих (например сов 1), выделением и очисткой целевого продукта,экспрессии )п ч)1 го. Описаны пригодные векторы экспрессии клетки, трансформированные рекомбинантными плазмидными ДНК, кодирующими Э ПО. а также схема очистки ЭПО.Способ состоит в том, что предварительно ЭПО подвергают очистке до гомогенности и переваривают трипсином. Эти фрагменты очищают и определяют нуклеотидную последовательность ЭПО. Синтезируют олигонуклеотиды, зная эти последовательности. Олигонуклеотиды используют для скрининга человеческой геномной библиотеки. из которой ген выделяют ген ЭПО.Получают кДНК-библиотеку печени плода человека и подвергают ее скринингу, Получают три клона кДНК ЭПО (после скрининга750000 рекомбинантов). Два из этих19 1801118 20 в вектор р 91023, или рАЮ 265 ЗЧр, или ВК 1-4, или рб В РУ-М МТпео, или рИЕУЯВОКрй 1, трансформацию полученными ДНК штаммов клеток млекопитающих и насекомых, после афинной хроматографии проводят обращенно фазовую хромасссСЗсзсзг , сс 5 ссссссе ссссзе 1 ссс Ссдс"ССЗС-2 УМе.а СЬЧг ЧАЬ И 15СЬИ СТЗ ЛТС ССС СлС САС СЛЛ ТСТЙ РЗО ССТ 88 ссассс 88 с 8 сСссссз 8 8 ссвсссз 88 Ззссссдсс з-"с 5 сдз 8 ТР ЬЕИ ЬЕИ ЬЕО ЗЕИ ЬН/ ЬЕО ЗЕВ ЬЕО Рл 10 ЬКц СЬТ ЬЕц РЕ 0 ЧЛЬ ЬЕО СЬТ СТТ СТС СТС ТСС С С С С Тсс СТС ССТ СТС ССС СТС ССЛ СТС СТС ССС 20 Ьец С 1 ц Л 1 з Ь в"пи тур суа Л:а саг ССЛ ССА ССС СТС ЛТС Тст СлС лсС 10Лг" Чз 1 Ьец С 1 ц Лгдг Ьец ТТС СЛС ССС ААС ССЛ СТС СТС СЛС ЛСС ТАС СТС5 И Л 1 з С 1 ц Ив 11 е Тт 75 Сл Сув ССС СЬС ЛЛТ ЛТС АСС ЛСС ССС ТСТ а 40 Ьец Лвз С 1 ц Лзц 11 с ТЛС ТТС ЬЛТ САС ЛЛТ АТС ЛСТ30 5 И Л 1 з СТц БТз Суз ССТ СЛЛ СЛС ТСС С 1 ц Ззл ЛСС САС 60С 1 у С 1 з 01 з А 1 аССС Слс САС СССпп80С 1 у С 1 п Аз Ьуц 50Л 1 з Тге Мес ЛТС тас уап лар туа Суа иа 1 л и ррп г гстс ссл слс лсс ллл стт ллт ттс тлт С 1 ц Чз 1 слс стс Ьчо . ЛгвЛЛС ЛСС ССС ТСС 70Чз 1 С 1 ц Чз 1 ТСР 01 з С 1 у Ьец Л 1 з Ьец 1.зц Зег СТц Л 1 з Чз 1 СТЛ СЛА СТС ТСС СЛС ССС СТС ССС СТС СТС ТСС СЛА ССТ СТСи Ьец г 8 СТС ССС ССС СЛС ССС СТС 100 1в Л 1 а Ча 1 Зсг ллл ссс стс йст арау леп Ссг Сг Суа ну т. С 90 го .ел С Ч ву ТТС СТС ЛЛС ТСТ ТСССЛС ССС ТСС СЛС ССС СТС СЛС СТО СЛТ СТС СЛТ 110 туг са, саи лгл.20С 1 ц Ллз Пе ЗегСЛА ССС ЛТС ТСС- СОл 11 г РЬе Лг С 1 у Ьец Лгс Зег Ьец П,г ССС СТТ ССС ЬСС СТС АСС Л 1 а Ьец С 1 у Л 1 з ССТ СТО ССА ССС С 1 з 1.ув СЛС ЛЛС Л 1 з Лв ЛСТ СТО СТТ ССС 130 Л 1 з Л 1 зРго ЬецРго Рго Ав Л 1 з Л 1 з Зег йг г ТИГ 1 лс 1 г сст ссл слт ссс ссс тсл сст сст, ссл стс ссл лсллтс лст сст САС ЛСТ ТТС ССС АЛА 150сту Суа т,еи Сда Саи ССС ССЛ АЛО СТС ЛЛС СТО 160 Тгг ТЬг С 1 С 1 ц Л;зСеи уса лг тпт т г;аг лап ре ТЛС ЛСЛ ССС САС С;С СТС ТТС ССЛ СТС ТЛС ТСС ЛЛТ ТТС СТС ЗИ 166 Зе лгу, тЛг слу лар лга ТСС ЛСС ЛСА ССС СЛС АСА Сссссзсссс ТСЛ ссздсБ а с 8 ссасссссдсагзссса ссассссссс сассвасасс Задсссс 8 сс 8 а 88 дсссс са 5 сссзсс 5 ссзсссСЗсс сасссссссс сссзсс 8 ссз з 5 адззсс 8 сссз дссс Зсззссзсзс сссаэасз 8 с азсссс 8 а а вадзссз 8 сС ссзаасссз 8 сссз зссз 8 Ссзсасдссазссс 8 зйд 8 азСсзссса асссс 8 саза вссс 8 асвсс вдасзс 8 сс.ас 8 ссд 8 зз Ззс 8 ссссзс сссзсссдс Сссзссс 8 сс Сдз 8 ззссс а 88 сдсаа 8 Зссссссс 8 а и сассДДс 8 ссзз 8 сссс 5. с 8 сасссссс ссзссзвда ссс сзсссз сздзс 8 зсс Зсзссссссс дсдсзвзв Сссадсссс асд 8 сас 88 Зсссссдсс сссвсд 58 с с 8 аз 8 асз 88 всддвсС 8 ааваазазззза ааассассаа асаа 8 вассс Зссс 8 свсса ссасдзсас сссзадзс 8 дзсз 8 зссс ссдздсса сс 5 с 8 асссс Зсд 8 азсса аассссасс 8 тографию и элюцию 10-70% градиентом 0,1% СРЗС 02 Н в СРзС.2. Способ по п 1, о т л и ч а ю щи й с я 5 тем, что фрагмент ДНК, кодирующий эритропоэтин клонируют в вектор р 91023, а трансформации подвергают клетки со 5 1. сссСЗсзссга сссзссССсс сД 8 зсвзЗД ссссс 88 с 8 СЛСТ СТС ССЛ СЛС ЛСС ЛАЛ СТА ЛЛТ ТТС ТАТ ССС ТСС ЛАО Т 1 г Уа 1 Р 1 сЛзр Т 1 г У,уз ,га 1 Лзге Р:"ае ТугА 1 а Тгр уз АСС ЛТС ОАСадйссЖСьШИйЗЖссЖсйЖуг арааьсйсаЖсааасс 11 г.АгИЕТ Иц с 1 а 1 Шрра 1 е ааааа;рггаа 1 рас Таблица 2-27иГ Оу уд н 3 бац счев Рво дед твр кц твр. скц ыц .Ец ваяв ы .кц язв ец вво а о,ч кц вво чд ыц ы О гоЛа Рго Рго Аг Ьсц Ие С в Лв Зсг Лг Ча Ьсц Си Лг Т г Ьеи Ьец Сц А 1 а Ьуз зо 50Сц Аа Сц Лвп с Т 1 г Таг Су Сув Ла Сц в Суз Зсг Ьеи Лвп Сц Авп 1 а ТцгЗН 5 ОСп Ла 50Лвп Рас Т г Л 1 а Тго Ьгв Лго ае 1 Сц Ча 1 Су С 1 п аЧа Рго Лвр Таг Ьуз Ча С Сп 50Ла Ьсц 70Ьси Ла Ьсц Ьец Зег Чв Сц Ча Тгр Сп Су С 1 и Ла Ча Ьсц АгЗ 100 Ча 1 Зег90Рго Тг Сц Рго Ьси Сп Ьсц 1 Пв Ча Аз Ь в Ла Ьеи Чв Авп Зег ЗегСп 15Ис Зс 110АгЗ А 1 а Су Ьец Лгз Зсг Ьеи Тпг Тйг Ьец Ьец Ьеи Су А 1 а Сп Ьуз Сц Аа ТЬг 1 о Тпг А 1 а Ав Таг Рйс 11 Лг Ьу130Ьсц Аг Рго Рго Лв Ла Лс Зсг Лс Ап Рго 150тч 5 ег Л и Раз а аг йу Ьу Ьт Ь Ьц тра ТВ а 16 Си ЛМ,Ра Маг аЮ:.са а аг су ЗН 166 Лвр ЛгЗЛСО 0 СС ТОТ ОСТ СЛЛ СЛС ТЕС ЛСС ТТО ААТ СА 0 ЛАТ АТСТйг С 1 у Суз Л 1 а С 1 ц Н 1 з Суз Яег ец Азп Иц Азп Пеа О О н о ьЭР Мсла оСФ Мь 3 саР ЬОо сФо сэ О и О с О Ь Ц ц28 1801118 27 о щ и СО ЬО ф СО Щ о м ЬО Щ ф ц СО СО и ЬО ЬО Щ Р й О и и Щ ЬО и и о о ЬО о о Щ Щ Щ ы о Ю о сО Щ о ц ЬО о СО Щ о О СО Щ ц и и О щ и щ о н и о О О о ЬО О н О о н о СО СО сО о о о ф о СО и ц о О ц Ц ц ц о О о офЪ О ч 2 о н о о ЬОи СО сО Щ ц ц И О О о Щ О о СО о 3 и Р о Щ ц СО ц и, и ЬО и и О щ ЬО о СО СО СО сО ЬО и Щ и и СО и ц о и и и о о о о о о о о н Ае с мсЮ5хМФ с"ос ва р. ц, о фо чэоС о С о о о о и ю о и ф о Щ Щ ц о ф ц и о о о и о о Щ о о Щ о о и Щ и Щ ц ЬО сО СО ц ц ф ц о иЬ О О О и О о о Щ о ф о ц СО и ы ы ц СО о СО о о О ц Ц Щ сО ЬО и о Щ СО оО 1 Щ СО Щ Ц о СО Щ Щ ц .ЬО Щ о ЬО Щ о ц и о Щ ц Щ оО ЬО ы Щ о о ЬО и Щ СО СО Щ Щ ы ц и Щ о ы Щ ц сО Щ СО и о СО о Щ о Щ ЬО ЬО Щ о ц СО ы Щ СО и и ы Щ Щ Щ СОсО ЬО о СО и ф о о сО Щ СО Щ ц СО Щ СО о со СО г 3 М СО ы м СО и ЬО СО оО ЬО О о Щ О О и О ЬО СО Щ о О и О СО сО и О о О СО ЬО и О Щ ЬО Щ Щ О ф СО и и Щ О и о О Щ Що вИ Ю о и сфъ м ь ь М Ю ь Оъ ь ь РЪ ь Ю О СО сб с 3 0 0 а ч 4 О и об и о и О о С 3 а сб сб оо сб 4 а о о об и о о с 3 о о а о СО а об сб ы о сб ц СО сб сс о о а а и а сб и О сб а а и 13 сб и о сб а а сб л аие йиййсб иаиои и)исб ииц иисбиоЕиОч ии,- ио Ели ичи иос)сбоиоло0ОО Еиц иЕ.иОчоиоосб иио Елийоо.5о ииасби сб и а с.б с л сб СО сб ч а с 3 а сб а о сб ьб сб сб и о СО а СО О а Сб сб а а сб СО а О а л сф об Сб ии Ю об а о с,3 и и О сб иф сб а СО и О о а ч сб а о Сб сб Г с.3 сб Сб с о О сб СО аОсб иа ио Со, Сбсб иСО ио ио иоо СбО (.7а иоб ио иЕло иО исб ла сэОа иии иа сбСО ис 3 иО Ссб ии сбац иаО Ело оч сбиСбиО Ело ио и0 иоо ио иа ич иООо оо ои обО СОи сбч ио ооб оцО иСОо ас 3 СО О о о О а сб ч об Сф и о 0 ц о об а о об а О сб иц СО 63 СО и и ф с.) .Э и и об о о и Щ0 ач аа оЕ СО СОа оС а обаО иСОО сба сб сбО аО ачО Ои. осб иа ьбьб аи 0о чи. СбО, Ои 0ю 3 иО 0СО сба цО обОО у нс 3. аа СОос.б ца оо ои иО иа имчсбоб оии чиО аа сба цО иО обО иа сбСбцмО сби щи оООоб оОО Осб ои цц сбии ао сбсбИ СО о о о сб о Ю 4 о СО о ч о ч Ооб об о и О сб О Сб а сб сб О и о С 3 Ч о о о О сб О и о о сб и щ ц О СО сб и а сб об, О сб о о сб О и о ч сб о сб и СЗ сб а ц О об О, сб О а а о сб о о о сб а о а О О о и и о оо ч сб о а О сб и СО о о О о о сб О и сбсб ии иЕл Си сб. исб иси сбЕлииии иии сби сбС Си ии иЕл ии иисбЕлиЕл ии сбсэ. сби ииие йЕлиС сбии лЕл Си сби ии ииииии ии ис ии иСи сзи ии иЕл ииЕли иСб, ьи)и сби иЯ иСб ии иси, йииСб ии и и ои оСО ци аЬ 2ц СО0 аи с 3обсб ис,бсбО ио ио оСО ОО сбо оо сбоб сбо оО ОоИ сбо сбоб аосбсл исб ии сбО сбсб сбсб иСО ОО сбоб сбо иСбО СОсбсб Ои сб сфив.йСС ии,. с 3он ис 3 О(3сбИобСРН ОЬСб ои и оЕл 0 Ои ОС .сби аСб ии иСб иии сбС 5 сби сб О а а ч СО сб а сб сб сб сб и ц О и сб а сб сб сб сб сб и О а с б сб сф о сб а о о сб и сб о а ц ч ы о о СО а о сб сб сб Сб и Сб Сб СО сб Сб а сб сб сб сб сб а а со СО О об а с 3 об СО и 4 с 3 О О с.б и сб и О СЭ и О и и Сб сб об об Ы с.б и й сб сб Ц а сб а а сб сб Сб еб а сб и сб сбСО сб са и и сб с 3 о а О а сб сб сб СО а п 3 сб Сб и о о а СО и О а а СО а СО и и а СО сб а ц сб а О сб СО о О а о сб сб сб е.б СОсб сб Сб сб об О О Сб и оф Сб и о СО СО СО и сб ,а а сф а сб СО о о сб сб и и и сб а СО и и Ц сфц и ц и С о ц О 4 а об О Ра 4 сф о об и н С. сф 0 асб 3 а 0 Л О 4 ССГ иозеф нл сб у 1 л а л д ц-3 О -об О, Сб Р сб цл ал И 5 С 3 и 14 Ои 2 сб О л С 3 СО. жид СО и ц 4 о ,иоо Ю цъ о Ю гч СЭ СЪ О о м ФЧ Ьб ьо и О о ьб С 3г 4 ЬО С 3 Ьо и ьо СО О р О О О ц СО ЬО О и И О о ЬЗ 3 ЬО ф Ц Оьб ьо СО О О гб.3 34 55 с и 3Ф и КО о о ОО СОСб Ьл и О и ЬО Ф О ф с 3 ЬО Ф Ф ф и ф О го О О о о О У СО О С 3 О С 3 ЬО г 3 О СО О Й ЬО Сл ЬО и ьб СО и ЬО ьо ЬО ЬО и и и ЬО ьб ЯО СО р О О СЗ О г 444 О О ф С,б г 3 О СО фО СО Щ ,ф О ьо 3 ьб, ф г 3 О Ьо С 3 и О фф С 3 Ьб ЬО С 3с - О С 3 с сз О Рл .3 -ф ч ,м.3 С 3ьС ь- О ОСР Д 1 3Я С 3И о ффь с ч оэ о г л ф СО -Г.3 7 т- О .3 Ю ф о Сб и СО СО и О ЬО ЬЭ СО О О О ц ЬО О ЬО ЬО М о,и и О О и ЬО 3 СО СОЬО О ЬО СО ф ЬО р иЬО ЬО ф О О О СО О СО и и О ЬО ц и ; СО СО О СО ьб ЬО о СО ЬО С 3 СО и О Ьб ЬО О ЬО ЬО и и и Ь 3 ЬО г 3 О о О Ьб О и ЬО СО и ьб Ьб и О ьб и Ьб СО и гд и и ЬО СО СО и О и и Р 4 с 3 ее 3 О О Сб 4 и О ф ьб г 3 СО 3 ь" и и. и г 3 и Ьб О О О СО 3 О О О ЬО ц ьб. р и О со. и ц с 3 О и ьб и с 3 р,ьб О О г 3, О О О О и ЬО О и ьо Со ы и О ЬО и г 3 О и ь 3 ЬО О О ЬО 4 г 3 и О о и и сб и О ьб ЬО ьо и ььС 3 О ЬО г 3 с 3 О С 3 ЬО О. ЬО О О о СО ьо ЬО ЬО и и и о и Оьи ье О и ьб и и о1801118 ф Ф ф гФ О ьо О, и ЬО ьй и ЬО С 3 ф ф с 3 О ЬО ф и сб ф и ф 4 ф О ЬО и г 3 и ЬО С 3 О О О 3 г.3 ьб о О и и ф о о о сО и и ьб О О и ф.Щ о О ьб о и О й ьб Ц й ф и ц Гь 3 О СО и ф и ЬО О ьб и,сЬ и й и о О о ф и ьб и и ф О и и о 3 ЬО и О.и и и О и и СО ЬО СО О ф ц и д и о а О ф Ц Сб О О Ьбь ф ЬО иь Ы и г 3 ф 4, ц г 3 сб ьф о и и о 0 и О ЬО ф О Ьб ьб и о г 3ц и ьо и и ЬО ф и ф ф са и О и О ф О ф.ф ЬО ф О Сьь Г 3, и ф ф и ц ь 3 и% Т о С о а Е ь о 4 Ч ь Щч М о и О Ч с О о и О О о О О Оо о о о а о О о с с е- О О О О и,с е- и о с С о Ц О С Е О С о о о с оо ц С о 13 о о с с ои О с О сф о О О ОО с. о о и О о о с оО Е о С о с о и о с и О Е ОооЕс ц со о и и о о О С О о с.о О О О с с о с о с О О С О и с о С о О с С О о , ОсЕ о и о О о И с о ц о оС О О с с о ОО О 2ООО О СООО ни ЕС ооо о одобно:)О ОО ооо и Сноф О ОООО и фце,О иц фо О с сди о а,е,с чоф ООцо О ГО,О н мф фцо)со О лц Е Он., фи ООЦ ОНОО Е ф фоС О ф л О Р Я ю 4 ф с о М с Ф 4Р Э ь-ЕЕм Е 4 Ф И ЬО3 О е г 3 лО и Ф И ф Фс И Ръ н О С О Р Ф ю-Е О Щ ф ЬО М ф О ф сб ф с 2 М Ц ф м О ьЭД м О с М М М ф ф М М еб Щ ф ф сО с 4 43 О о о сО й о Ю и О 44 О ф О ф М СО М Я Я сЗ ВО См и Ь 3 ф И ЬО и 14 Е Оъ е и ь ц е О и о С Е Е фЛО г.сн о)о ф с сс иапо е.ц ло оС сн е,о О Ор.сЕ офолс35 1801118 36 н о в о и 1 н н Е.фй сСо О О н с) о е 4 во оо ЮС О о о О во г н н С а ОЕ своо С О г о с) О ьь онсо сй Е Ф й фР и Щ о ео ьь и Р Р О Е о ьц ьь м Р Щьь и б ьцОгО ОО Лс Ьо б Е н о С О д Ов.ьоо н О со ао осна о З О ао й С СО д Ъ О соР и СО и Р М Ю Ф ьь ьь ос н о цо ос н о Р о ос н о ю. о а оО С О ео юо С О о Е но а. о Щ Ф ьО ы Ш ЮьО щ ьььь ьь аю ВО 0 Р1 Я ЩЩ нЩ Р У 3 ь 4 око О о и ЕО цЬф и О оц о ан оно л ц спиц О оо э но 4 о Рао1801118 38 37 Ьб ф ф ЬО Ьб и ЬО ЬО ф 34 С ,ф О -4 С о о ф ЬО и ф ЬО и ЬО Ьб ЬО ЬО и ф:3 О О 3 Н 3 О 34 О щ О 03 44 и и ЬО и ц ц ф и и и Х 3, 443 О о ьфом,ао ф:3 О хО о М с о с о ь ьбц ц 34 О -4 С о м ф О ф ф О ц ф О и 0 О О о о ф О о и О О ф о ц и Ьб и ЬО и ьб ЬО ф ц ц СО ч с 4 о ЬОС О 34 ОдО ц 3 С 3 О н о о о О ЬО и о О ЬО ф О О ЬО о ЬО ф ц и о об ф 0 и о О ьб ЬО об об ф ьб и ЬО ц ц о ф ф 60 О о ц о и О ц о ф ц ф о ц ЬО и ЬО и и о ЬО и о о о ф О о об О ф ц О ЬО и об ф О ц и о о ф ЬО ЬО и ф о о и ф о ф ЬО и ф ф о ЬО 6 О ф О 44 О ф. ф ф и о и ф о ьб ф ЬО ф ц ЬО ф Ьб ф ц ц ц о ц Ьб об ЬО ф ц ф о и Ьб и ф Ьб 60 ф ф и О и О 0 ЬО и ф ЬО и и и ф ф ф ф О ЬО ц о о ф О ЬО ЬО о ц ф о 44 0 ф ф ЬО об ьб и о ЬО и ф ц о ьб ф Ьб ф о ЬО об ф Ьб и о о ьб ц ф ЬО м ц ф ф ьб ф ЬО ЬО и ф и о о ф ц ЬО о и и ЬО и ЬО ЬО об ЬО ц. ц ф о ф ьб и ц о о О о ЬО й ц ц ц о ф О Ьб О и О и ЬО об ф о о ц и и ц ф ЬО и ЬО и о об ьб и ф о ьб ьб об о ф о и и о и и ф и ЬО и ьб и и Ьб ф ф О о и 0 об Ьб и о и О ц Ьб ф ц ц ф ф Ьб об ЬО ЬО об и о Ьб ЬО об ьб Ьб и ф ьб и 0 ф ф об ф ф ц ф ЬО и и ф 0 О ц ф ф ф ц ц ф ц о ф ф ф510 15 20 25 30 35 40 45 50 55 трех клонов имеют полную длину, Эти кДНК клонируют в вектор экспрессии, трансформируют ими клетки вируса ЯЧобезьяны (клеточная линия СОЯ), а также клетки яичника китайского хомячка (клеточная линия СНО), ЭПО, полученный из клеток СОЯ, является биологическими активными ЭПО 1 и н 1 тго и 1 и чво. ЭПО, полученный из клеток СНО, также биологически активени ч 1 тго и 1 и ч 1 чо,кДНК-клон ЭПО имеет открытую рамку считывания из 14 - 15 аминокислот(аа) с инициатором и терминатором из 20 - 30 нуклеотидов (Ь 1) вверх по направлению кодирующей области. Образец Е.соИ, трансформированный клонированным геном ЭПО, депонировэн в Агиег 1 сап Туре Сц 1 шге СоИест 1 ои, ЯосК чИ 1 е, Магу 1 аис 1, под номером АТСС 40153. Основные этапы способа состоят в следующем. Выделение геномного клона человеческого ЭПО,1. Человеческий ЭПО очищают до гомогенности из мочи пациентов, страдающих апластической анемией, Полное переваривание этого очищенного ЭПО трипсином протеазы дало фрагменты, которые разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой, подвергают секвени рован ию (см. табл,2 и 3). Две из аминокислотных последовательностей Ча-АзЬ-РЬе-Туг-А 1 а-Тгруу и Ча-ТугЯег-Ази-РЬе- ец-Аг 9, выбирают для конструирования олигонуклеотидных зондов,Олигонуклеотиды используют для скрининга человеческой геномной ДНК-библиотеки в векторе СЬ 4 А.Фаг, гибридизирующий к 17 мег, отбирают распределяют на малые группы и гибридизуют с 14 мег и 18 мег пулами, Фаг,гибридизирующий к 17 мег. 18 мег и 14 мег пулам, очищают от пятен. а фрагменты субклонируют в векторы М 13 для секвенирования путем дидезокси-метода, и получают два клона Л -НРО и Л - НЕРО 2,2, Выделение клонов кДНК ЭПО, МогсЬеги анализ сыворотки плода теленкаа (возраст 20 недель) печеночной м Р Н К осуществляют с использованием 95 и 1 однонитиевого зонда, полученного из клона М 13, содержащего участок 87 Ьр экзона, описанного в табл,1, Далее мРНК ЭПО идентифицируют с использованием того же зонда для скрининга Л -кДНК библиотеки бактериофага мРНК сыворотки плода теленка, Несколько гибридизирующих клонов получают с частотой приблизительно 1 положительный на 250000 подвергнутых скринингу рекомбинантов, Полная нуклеотидная и аминокислотнэя последовательности для этих клонов ( Л-НЕРОЕ 113 и Л -НЕРОР 18) представлены в табл,5 и б.3, Структура и последовательность гена ЭПО человека. Гибридизационный анализ этих клонированных ДНК при помощи олигонуклеотидных зондов и различных зондов позволил определить положение гена ЭПО внутри приблизительно 3,3 кб области. Полный анализ секвенирования этой области и сравнение с клонами кДНК приводят к получению карты интронной и экзонной структуры гена ЭПО. Ген ЭПО имеет 5 экзонов. Часть экзона 1, полные экзоны 11, 111 и 1 Ч, а также экзон Ч содержат кодирующую белок информацию. Оставшиеся части экзонов 1 и Ч кодируют 5- и 3-нетранслируемые последовательности.4, Неустойчивая экспрессия ЭПО в клетках СОЯ.Вектор р 9 1023/В/ содержит основной поздний промотор эденовируса, последовательность полиаденелирования ЯЧ 40, ЯЧ 40 - начало репликации, ген-усилитель ЯЧ 40 и ген ЧА аденовируса. Вставку кДНК из НЕРОР 113 встраивают в вектор р 91023 и получают рекомбинантную плазмидную ДНК рРТР - 113, Полученной ДНК трасфектируют штамм Мб клеток СОЯ 1, клетки промывают, переносят в среды, не содержащие сыворотку, клетки собирают через 48 ч, С использованием количественного радио- иммунного анализа исследуют уровень экспрессии ЭПО в культуральную надосадочную жидкость, Вектор, содержащий кДНК ЭПО из Л -НЕРОР 113, трансфектируют в клетки СОЯ. Наличие ЭПО в культуральной среде определяют с помощью Н-тримидин и СРО-Е методом илизлюбым из двух анализов 1 и ч 1 чо. а именно гипоксическая мышь и голодающая крыса, Этй результаты показывают, что биологически активный ЭПО продуцируется в клетках СОЯ, Было установлено, что ЭПО, продуцируемый клетками СОЯ, имеет подвижность на ЯОЯ-полиакриламидном геле, которая идентична подвижности нативного ЭПО, полученного из человеческой мочи,Различные векторы, содержащие другие промоторы, также могут быть использованы в клетках СОЯ или в других млекопитающих или эукэриотических клетках. Примеры этих иных промоторов, которые могут быть использованы в заявленном способе, включают ранние и поздние промоторы ЯЧ 40, генный промотор металлотеоннина мыши, промотор, обнаруживаемый в длинных концевых повторах ретровирусов-"3 О О 3 Ч -3 ч И СЭ ш ч , о ло 03 ч -3 О о а чО О О ц оО ц оО О О Ф О и О 33юСа ф оф чф Оно о 3 О а с :8 Оз о о ч о 33. О оО О н О СС",э СЭ 34до ф о ч с д о ф О о ф34 О ы о И ч Н ОооИ оО оО ц ц О 6 оО ц оО о 3 оО оО ц О О н оО о 0 и о оО оО ОО оО оО О 33 чО оО Р оО и О оО О м О оО ф О Щ оОо 0 м ц Р О фо,ч ОС О ос но до о о аооО О О м О оО м О и ц оО иоО ОкооО 33 Оодццц Ще О, ООоОиоЭ Он Сь 0Оци Ои .3 ОО33- ОО,4 Ы41 42 10 15 20 30 35 40 моеф ао 50 жсмИ о оо д4 с аз Е-е фтс жо оо .о мо вйо оО мо О о м о 9 О о мо сч во л ц -ф м о м о и с мо м о со со о м (.3 со ао с.О М 4 ло ес.:32 о С) Н о 3 СЭ С 3 О сб Есб Ей л о со Е 2 оЮ ОЕл 3 О сФ Н гЮО Юанси цсф о о (О Щ, ф и и о о И о СО и о и М (О о о ф Сб (7 Сб и ц и о Щ Щ и Ю ОО 00 ООц о (О о 00 Щ ф о Щ сб и СО Щ ф о д 4 и И ц а ф ьб (0 (О и О о ЬО Я й о ОО ф ц и о ОО ф ц ОО ГД лл Щ сб о ф ф М Щ о ц и ф об и и о о о о о О ф Р о ф и ф о и ц о ОО 00 60 об(:. о щ С С О О в О О О и со нс ф о о СО и ФО и о СО о ф о Щ .СС М ф о ф ц ц ОО и ОО ГЦ о ц и йб (ю М Сб н и о (б ф о ц сб Щ СО ц о Ц ц М н ц 60у (О ц ф Сб сО ф о ц сб и Ьб н и ф ф ф Ю о йб о ц о о О Об о и ц ф ц о Щ Щ И и о о ЬО о ф сб ф ф М 00 Сб н ц СО н ф ф О М б ф о н о ц ф н ц о ф о Об ц и Г 5 00 С( об 00 ч (О сО н 4 СО и ц о Я н и н и и о о о и ц о Сб Сб Сб н ф ц сб сб 00 ф о и н ц Щ н О и о и о и сО об Я о ц и о и и о и и Щ иьб и бб и и и ьб (б о ц и ЬО СО об СО и ф о и ц и ц Сб йб и о о ц Сб и ц Об сб Сб М Сб ф 60 М ф о ф й Ц ф Щ Щ ф ф ф ф с 3 ф ф ГД ф ф ф о о Щ о ц ф Д ф б о Щ ф ЬО ф Ь (47180111848Таблица 8Таблица 9ЭПО, выделенный из клеток СОЯ, трансфекцированных кДНК ЭПО, тип 1 Таблица 10Уровень высвобождаемого в среды ЭПОблицавень высвобождаемого в среды ЭПО50 55 птиц или млекопитающих, полиэдральный генный промотор бакуловируса и другие. Примерами штаммов - реципиентов, которые могут использоваться в заявленном способе, являются Е,со 11, дрожжи клетки млекопитающих, такие как СНО (яичник китайского хомячка), С 127 (эпителий обезьяны), ЗТЗ (мышиный фибробласт), СЧ(почка африканской зеленой мартышки) и клетки насекомых такие, как клетки от Яросортега сгоц 1 регс 1 а и ОгозорЫа пче 1 апоцазтег. Эти промоторы и типы клеток могут обеспечить возможность регулирования уровня экспрессии ЭПО.Вирус ядерного полиэдроза имеет геном двунитевой кольцевой ДНК размером 128 кб. Нуклеокапсид вируса имеет палочковидную форму и находится упакованным в двух формах. Эти вирусы могут быть обычным путем размножены в культуре клеток насекомых. Среды для культивирования этих клеток - это обычно питательный солевой раствор и 100 -я фетальная телячья сыворотка. 1 и чсго, вирусный рост инициируется, когда неокклюдированный вирус (НОВ) входит в клетку и продвигается к ядру, где он реплицируется, Репликация является ядерной, В течение начальной фазы (8-18 ч постинфекции) вирусной аппликации нуклеокапсиды собираются в ядре и впоследствии проходят через плазменную мембрану распространяя инфекцию по культуре клеток, Кроме того, некоторые нуклеокапсиды впоследствии (еще 18 ч постинфекции) остаются в ядре и закупориваются в белковой матрице, известной как полиэдральное внутриклеточное включение (ПВВ), Эта форма не является инфекционной в культуре клеток. Матрица состоит из белка, известного как полиэдрин, молекулярный вес 33 кд, Каждое ПВВ имеет приблизительно 1 мм в диаметре и в ядре могут быть до 100 ПВВ, Ясно, что большое количество полиэдрина продуцируется позже в цикле заражения и оно составляет до 25 ообщего количества клеточного белка. Так как ПВВ не играет роли в цикле репликации и чтго, полиэдриновый ген может быть убран из вирусной хромосомы без какого бы то ни было влияния на жизнеспособность и чтго, При использовании вируса в качестве вектора экспрессии заменяют область, кодирующую полиэдриновый ген, чужеродной ДНК и помещают ее под контроль полиэдринового промотора. Это приводит к вирусному фен отипу, не образующему ПВВ. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Описаны рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие ген ЭПО под контролем промотора вируса ядерного полиэдроза,В результате генетической рекомбинации происходит замещение области полиэдринового гена Азй РУС дезоксирибонуклеиновой кислотой из плазмиды.Рекомбинантный ЭПО, полученный в клетках СНО, очищают традиционными методами колоночной хроматографии,Биологическую активность очищенного рекомбинантного ЭПО и ч 1 го определяют известными методами (биопроба на пролиферацию клеток селезенки).Удельная активность и чтго полученного и очищенного рекомбинантного ЭПО составила 200000 ед,/мг белка, Среднее значение находится в интервале 275000 - 300000 ед./мл белка, Наблюдались значения выше чем 300000. Отношения активности п ччо к активности и чтго, исследуемые для рекомбинантного ЭПО, равны 0,7 - 1,3.Изобретение иллюстрируется следующими примерами,П р и м е р 1, ЭПО очищают от мочи пациентов, страдающих апластической анемией, известным методом за исключением того, что опускают фенольную обработку и заменяют термообработкой и ри 80" С в течение 5 мин для инактивации нейраминидазы. Конечную стадию очистки проводят путем фракционирования на колонке Счуас высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием от 0 до 95 оацетонитрильного градиента с 0,1 отрифторуксусной кислоты (ТФК) в течение 100 мин, Положение ЭПО в градиенте определяют электрофорезом в геле и анализом М-концевой последовательностью основных пиков, ЭПО элюируют при 53 оацетонитрила и обнаруживают приблизительно 40 обелка, подвергаемого высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой, Фракции, содержащие ЭПО, выпаривают до 100 мкл. доводят до рН 7 бикарбоната аммония и обрабатывают 2- ым ТРСК-обработанным трипсином в течение 18 ч при 37 С. Полученные фрагменты подвергают ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано выше, Хорошо отделенные пики выпаривают почти до сухости и подвергают непосредственно анализу М-концевой аминокислотной последовательности, используя газофазный секвениатор модели 480 А, Определяют последовательность, приведенную в табл, 2 и 3. Два фрагмента, полученные в результате обработки трипсином, отбирают для синтеза олигонуклеотидныхзондов. Из последовательности Ча 1-АзпРЬе-Туг-А 1 а-ТгР- уз получают 17 мег со следующей нуклеотидной последовательностью,А А А ТТССАМОСОТАОААОТТи 18 мег со следующей нуклеотидной последовательностью А А А ССА 1 чОСОТАОААОТТКАС, Из последовательности, Ча-Туг-Яег-АзпРПе- ец-Аго получают два пула 14-меров. ТТОМТТ ТТОМТТ ТАСАСТААСТТССТ и ТАСАСТААСТТСТТОлигонуклеотиды метят в 5-конце Р, ис 32 пользуя полинуклеотидную киназу и гаммаР-АТР, Удельная активность олигонуклеотидов варьирует между 1000 и 3000 дюйм /ммол олигонуклеотида. Геномную ДНК-библиотеку человека в бактериофаге лямбда подвергают скринингу. Приблизительно 3,5 х 10 фага высевают с плотностью 6000 фага на 150 мм чашку Петри со средой К 2 СУМ и инкубируют при 37 С до тех пор, пока пятна не станут видными, однако маленькими (приблизительно 0,5 мм), После охлаждения при 4 С в течение 1 ч дупликатные реплики переносят на найлоновые мембраны и инкубируют в течение ночи при 37 С на чашках со свежими средами М 2 СУМ, Затем фильтры денатурируют и нейтрализуют в течение 10 мин каждого на тонкой пленке 0,5 Н МаОНМ ИаС и 0,5 М Тпз (рН 8) - 1 М ИаС соответственно, Вслед за вакуумной сушкой при 80 С в течение 2 ч фильтры промывают в 5 х ЯЯС, 0,5 ЮЯ в течение 1 ч и клеточные остатки на поверхности фильтров удаляют путем осторожного соскоба сухой тканью, Это соскабливание снижает фоновое связывание зонда с фильтрами, Фильтры затем промывают водой и предварительно гибридизируют от 4 до 8 ч при 48 С в ЗМ растворе тетраметиламмонийхлорида, 10 мМ КаРО 4 (рН 6,8), 5 х ОепЬагссз, 0,5% ЯОЯ и 10 мМ ЭДТК, 17 мег, меченый Р, затем прибавляют при концентрации 0,1 пмол/мл и гибридизацию осуществляют при 48 С в течение 72 ч. Вслед за гибридизацией фильтры промывают экстенсивно в 2 х ЯЯС (0,3 М ИаС - О,ОЗМ цитрат натрия, рН 7) при комнатной температуре и затем в течение 1 ч в ЗМ ТМАСРмМ МаРО 4 (рН 6,8) при комнатной температуре и от 5 до 15 мин при температуре гибриди 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 зации. Приблизительно 120 сильных дупликатных сигналов обнаруживают вслед за 2-х дневной авторадиографией усиливающим экраном, Положительные сигналы отбирают, группируют в пулы из 8, пересевают и вновь подвергают скринингу с использова. нием 1/2 14 мег пула на каждом из двух фильтров и 127 мег на третьем фильтре. Условия высева и гибридизации при этом те же, но гибридизацию осуществляют при 37 С, Вслед за авторадиографией зонд с фильтра переносят в 50%-ом формамиде в течение 20 мин при комнатной температуре и фильтр повторно гибридизируют при 52 С 18 мег зондом. Два независимых фага гибридизируют со всеми тремя зондами. ДНК из одного из этих фагов обозначают здесь Л-НЕРО 1, Переваривают рестриктазой ЯаоЗА и субконируют в М 13 для анализа ДН К-последовател ьн ости.П р и м е р 2, 5 мкг мРНК человеческой печени эмбриона и мРНК печени взрослого человека подвергают электрофорезу в 0,8%- ом агарозном формальдегидном геле и переносят на нитроцеллюлозу, Однонитевый зонд получают, из матрицы М 13. содержащей вставку, показанную в табл,1. Праймером является 20 мег, происходящий из того же фрагмента, что и первоначальный 17 мег зонд, Получают зонд за исключением того, что вслед за расщеплением Япа 1 малый фрагмент очищают от М 13 хроматографией на колонке с Сефарозой С 14 В и 0,1 К МаОН - 0,2 М МаС 1. Фильтр гибридизируют приблизительно до 5 х 10 отсчетов в минуту сбэтим зондом в течение 12 ч при 68 С, про- . мывают в 2 х ЯЯС при 68 С,П р и м е р 3, Зонд, идентичный описанному в примере 2, получают и используют для скрининга библиотеки кДНК печени эмбриона, полученной в векторе Л -СЬ 21 А, используя стандартные методики скрининга бляшек. Три самостоятельных положительных клона - обозначены здесь Л-НЕРОРб (1350 пар оснований), НЕРОЕ 8(700 п.о.) и Л-НЕРОР 13 (1400 п,о,) выделяют вслед за скринингом 1 х 10 бляшек, Полную вставку Л -НЕРОР 113 и Л -НЕРОГ б секвенируются вслед за субклонированием в М 13 (табл. 7 и 5 соответственно). Только часть вставки-НЕРОР8 секвенируют. Остальные фрагменты считают идентичными двум другим клонам (табл.7). 5 - и 3- нетранслируемые последовательности представлены строчными буквами. Кодирующая область представлена прописными буквами,10 15 20 плазмида содержит кДНК-ген дигидрофолятредуктазы мыши (ОРНР), который находится под контролем позднего промотора 25 аденовируса 2 (Аб 2), 5-часть аденовирусной ДНК и 3 -часть гена иммуноглобулина, межВ отношении табл,2 и 3 следует упомянуть, что определенная аминокислотная последовательность, показанная ниже нуклеотидной последовательности, пронумерована начиная с цифры 1 для первой аминокислоты созревшего белка, Остатки цистеина в созревшем белке дополнительно указаны ЗН, и потенциальные М-сайты гликолизирования обозначены звездочкой. кДНК-клоны Л -НЕРОР6, ЛН ЕРОВ8 и Л -НЕРОР13 задепонированы в АгпегсапТуре Сцыге СоеИоп, Ростане, Магуапб под номерами АТСС 40156, АТСС 40152 и АТСС 40153 соответственно.П р и м е р 4, Геномные клоны Л -НЕРО 1, Л -НЕРО 2, Л -НЕРОЗ и Л -НЕРО 6 депонированы в АаегсапТуре Сцтаге Соестоп, Рос 1 че. Магуапб под номерами АТСС 40154, АТСС 40155, АТСС 40150 и АТСС 40151 соответственно, Используют вектор рА 026 ЯА рА(3), эта ду поздним промотором аденовируса 2 и О РН Р-кодирующей последовательностью,рА 026 рА(3) превращают в плазмиду рСЧЗЧ 12. рАЮ 26 ЧЯ рА(3) превращают в плазмиду рА 026-ЯЧрА(З) (1 ) делецией одного из двух сайтов Рзт 1 в плазмиде рАЮ 26 ЯЧрА (3) путем частичного переваривания Рз 1 1 и получают субпопуляцию плазмид, в которой только один сайт Рзт 1 расщеплен, затем осуществляют обработку и лигирование ферментом Кленова.Плазмиду рА 026 ЯЧрА (3) ( ) расщепляют Рчц 11. Плазмиду рАИ/43 переваривают ХЬо, обрабатывают фрагментом Кленова, переваривают Рчо 11 и выделяют электрофорезом в акриламидном геле фрагмент размером 140 п,о, Фрагмент 140 п,о, лигируют с плазмидой рА 026 ЯЧ рА (3), обработанной с рестриктазой Рнц. Продукт лигирования используют для трансформации Е,со, колонии подвергают скринингу с помощью зонда, меченого Р, комплементарного к фрагменту из 140 п,о, ДНК получают из положительно гибридизирующихся колоний,Фрагмент Ача 110 вируса ЯЧ 40, содержащего последовательность энхансера ЯЧ 40, получают путем обработки ДНК ЯЧ 40 ферментом Ача 11, фрагментом Кленова Ро 1 1 с последующей лигацией ХЬо 1-линкеров, ХЬо-фрагментом и выделением фрагмента электрофорезом в геле. Этот фрагмент за 30 35 40 45 50 55 тем лигируют обработанной рестриктазой Хо плазмидой рТР и получают плазмиду рСУЯУ 2-ТР, Ориентация фрагмента ОЯУ 40 в рСУЯУ 2-ТР такова, что поздний и ромотор вируса ЯЧ 40 находится в такой же ориентации, что и основной поздний промотор аденовируса,Для интродуцирования генов ЧА в рСУЯУ 2-ТР вначале конструируют плазмиду рВВ 322, которая содержит в Нпб- сайте фрагмент В аденовируса типа 2, ДНК аденовируса типа 2 переваривают Нпб и фрагмент В выделяют электрофорезом в геле, Этот фрагмент встраивают в плазмиду рВЯ 322, которая предварительно была обработана Нпб, После трансформации Е.со отбирают рекомбинанты и ориентировку встроенных фрагментов определяют путем обработки рестриктазами, рВВ 322 - А Нпб В содержит фрагмент В Нпб аденовируса типа 2, Плазмиду рВВ 322 - А Нпб В обрабатывают Нра , добавляют линкеры Есор и гидролизуют Есой. Фрагмент. имеющий липкие концы Есор, встраивают в Есор-сайт плазмиду РТ, гидролизованной Есой. После трансформации штамма Е,со НВ 101 отбирают колонии, устойчивые к тетрациклину, далее на фильтрах колонии подвергают скринингу посредством гибридизации, ДНК получают из положительно гибридизирующих клонов и гидролизуют рестриктазами, Полученную плазмиду обозначают р 91023. Плазмиду р 91023 гидролизуют рестрактазой ЕсоВ и получают два фрагмента, один около 7 кВ и другой около 1,3 кВ. Последний фрагмент содержит гены ЧА, Концы обоих фрагментов заполняют с использованием фрагмента Кленова Рой и два фрагмента затем лигируют один к другому. Плазмиду р 91023/А/, содержащую гены ЧА, являющуюся аналогичной плазмиде р 91023, однако потерявшую два сайта Есор. идентифицируют посредством скрининга фрагментом гена ЧА.Один Рзс-сайт в плазмиде р 91023/А/ заменяют на Есор-сайт. р 91023/А/ гидролизуют рестриктазой Рзси обрабатывают фрагментом Кленова РоП для восстановления концов. Есор-линкеры лигируют с тупым сайтом Рз 1 плазмиды р 91043/А/, Линейную плазмиду р 91023/А/ с Есор- линкерами. присоединенными к тупым сайтам Рзт. отделяют от несшившихся линкеров и гидролизуют Есор рестриктазами, после чего повторно лигируют. Идентифицируют плазмиду р 91023/В/. которая аналогична р 91023/А/, но вместо прежнего сайта РзО в ней содержится сайт Есор, Плазмида р 91023/В/ депонирована и до 180111850 55 ступна из Ааег 1 сап Туре СО 1 мге Соестоп, под номером АТСС 39754,П р и м е р 5. кДНК-клоны ( Л-ЕРОР 16 и Л -ЕРОЕ13) встраивают в плазмиду р 91023/В/, получают плазмиды рРТР6 и рРТР13, 8 мгк каждой из очищенных ДНК затем используют для трансфекции 5 х 10 клеток СОЯ, используя ОЕАЕ-декстран-метод (ниже). Через 12 ч клетки промывают и обрабатывают Хлорохином (0,1 мМ) в течение 2 ч, промывают вновь и выдерживают в течение 24 ч в 10 мл средах, содержащих 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, Среду заменяют на 4 мл среды, свободной от сыворотки, и собирают через 48 ч,Иммунологически активный ЭПО определяют количественно радиоиммунным анализом, Йодированный изотопный индикатор получают из гомогенного Э ПО, Чувствительность пробы составляет приблизительно 1 нг/мл, Результаты приведены ниже в табл.8.П р и м е р 6. кДН К Э ПО ( Л -Н ЕГО 113) вставляют в плазмиду р 91023/В/, трансфекцируют в клетки СОЯи собирают, как описано выше. Однако хлорохинную обработку опускают,Биологическую активность ЭПО и итго измеряют с использованием либо колоние- образующей пробы с клетками фетальной печени мыши в качестве источника СРЧ-Е, либо пробы поглощения с Н-тимидином, используя клетки селезенки от мышей, инъ- екцированных фенилгидразином, Чувствительность этих анализов составляет приблизительно 25 мединиц/мл, Кроме того, биологическую активность ЭПО и что измеряют с использованием либо метода гипоксической мыши, либо метода голодающей крысы. Чувствительность этих анализов составляет приблизительно 100 единиц/мл. Никакой активности не обнаружено ни в одной из этих опытов с имитированной средой. Данные об активности ЭПО, экспрессированного клоном ЕРОВ13, показаны в табл.9, где приведенные активности выражены в единицах/мл, с использованием торгового ЭПО (ТоуоЬо, 1 пс,) в качестве стандарта,П р и м е р 7. Гель-анализ полиакриламида ЯОЯ ЭПО из клеток СОЯ,180 нг ЭПО, выделенный из среды клеток СОЯ, трансфекцированных кДНК ЭПО ( Л-НЕРОР13) в векторе 91023(В), подвергают электрофорезу на 10%-ом полиакриламидном геле. НПО обнаруживают с антителом анти ЭПО и белком А 1-стаф, Фильтр авторадиографируют в течение двух дней, Гомогенный ЭПО подвергают электрофорезу перед или после йодирования, Ис 5 10 15 20 25 30 35 40 45 пользуемые маркеры включают метионин, меченый Я, сывороточный альбумин (6835000 д) и яичный альбумин (45 000 д).П р и м е р 8, Фрагмент ВатН 1-Рчоиз плазмиды Рзч 20 Н РВ, содержащий ранний промотор ЯЧ 40, смежный с геном дигидрофолятредуктазы мыши (О НЕЙ), энхансер ЯЧ 40, малый интрон с и последовательность полиаденилирования ЯЧ 40 выделяют (фрагмент А). Оставшиеся фрагменты получают из вектора р 91023/А/ (выше) следующим образом, р 91023/А/ гидролизуют Рыв единственном сайте Рз 1около промотора аденовируса для линеаризации плазмиды, и либо лигируют с синтетическими линкерами Рз 1 1-ЕсоВ 1 и обрабатывают с помощью ДНК лигазы или обрабатывают большим фрагментом ДНК-полимеразы 1 для разрушения сайтов Рзт 1 и сшивают с синтетическим Есор-линкером и замыкают плазмиду. Каждую из двух полученных плазмид 91023/В/ и 91023/В/, обрабатывают ХЬа и ЕсоВ 1 для получения двух фрагментов (Р и О). Путем соединения фрагмента 6 из плазмиды р 91023/В/ и фрагмента Р из плазмиды р 91023/В/, а также фрагмента 6 из плазмиды р 91023/В/ и фрагмента Р из плазмиды р 91023/В/ создают две новые плазмиды, которые содержат либо сайт Есой 1-Рм 1, либо сайт Рэли-Есор.Вектор р 91023/С/ гидролизуют и полученную с липкими концами затупляют путем заполнения концов с фрагментом Е,со 1 ДНК-полимеразы 1, К этой ДНК лигируют с фрагментом Нпб 11-Есор размером 340 п,осодержащим энхансер ЯЧ 40, полученный следующим образом:Фрагмент Нпс 111-Рчц 11 из вируса ЯЧ 40, который содержит основу ЯЧ 40, а также энхансер вставляют в плазмиду с 1 ас пролгором, Вектор с 1 ас получают гидролизом ДНК с ВавН 1 эндонуклеазой, заполнением липкого конца с помощью фрагмента ДНК-полимеразы 1 и обработкой ДНК Нпд 111, В полученной плазмиде восстанавливают ВавН 1-сайт путем лигирования с Рчц и 11 линкером. Фрагмент Есор-Нпс 111 получают из ЯЧ НР 1 ас и сшивают с фрагментом Есор-Нпб 111 Рзч Об, который содержит плазмидную основу репликации. и отбирают полученную плазмиду РзчНРОб. Затем получают фрагмент Есор-Нпс 111 размером 340 п.о. плазмиды РзчН РОО, содержащий ЯЧ 40/энхансер, затупляют с обоих концов при помощи большого фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 и сшивают с вектором р 91023/С/, гидролизованным ХЬо 1/р 91023/С//ХЬо/ и Есор/Н 1 пс 1111 ЯЧ 40 энхансер/, в которой ориентация фрагмента Нпб 111-Есор такова. что ВагпН 1-сайт40 45 50 55 внутри фрагмента является близлежащим к гену ЧА, называют рЕЯ 105. Плазмиду РЕЯ 105 обрабатывают ВааНи Рчц 11, а также Рчц 1, и выделяют фрагмент ВагпН 1- Рчц 11, содержащий основной поздний промотор аденовируса (фрагмент В), и фрагмент Рчц 11 с геном устойчивости к тетрациклину, а также другие последовательности (фрагмент С), Фрагменты А, В и С лигируют и полученную плазмиду выделяют и обозначают ВК 1-4, Плазмида ВКдепонирована Авег 1 сап Туре Сцсцге СоИест 1 оп, ВосЫПе, Магу 1 апб, где под номером АТСС 39940,П р и м е р 9. ДНК (20 мкг) из плазмиды рРТЕ13, гидролизуют рестрикционной эндонуклеазой С(а 1 и лигируют с обработанной С(а ДНК из плазмиды рА 1 О 265 ЯЧр/А/ 1 /2 мкг/, которая содержит интактный гендигидрофолятредуктазы (ОНЕ В), под контролем основного позднего промотора аденовируса, Эту ДНК используют для трансфекции ОНГВ-СНО и после двухдневного выращивания клетки, которые содержат по крайней мере один ген ОНЕ В, отбирают в альфа-средах, не имеющих нуклеотиды, и пополняют 10%-ой диализированной фетальной эмбриональной бычьей сывороткой, Извлекают колонии из первоначальных чашек, объединяют по группам из 10 - 100 колоний на пул, повторно высевают и выращивают до слияния в альфа-средах, не имеющих нуклеотиды. Отстоявшиеся среды из этих пулов проверяют на ЭПО посредством радиоиммуноанализа (В 1 А)Пулы, которые экспрессируют ЭПО выращивают в присутствии метатрексата (0,02 мкМ) и затем субклонируют и анализируют повторно, С 1 а4 4,04-7 экспрессируют 460 мгlмл ЭПО. Он депонирован в Агпегсап Туре Сцтцге СоИест 1 оп под номером АТСС СР 18695. Этот клон подвергают поэтапному отбору при возрастающих концентрациях МТХ.Ступенчатую селекцию с метотрексатом (МТХ) достигают повторными циклами культивирования клеток в присутствии возрастающих концентраций метотраксата и селекции для выживших микроорганизмов. При каждом цикле ЭПО наличие ЭПО определяют в надосадочном слое культуры посредством В 1 А и определяют биологическую активность 1 п чего, Уровень используемого метотрексата в каждой ступенчатой амплификации составляет 0,04. 0,1 и 0,5 мкМ. Как показано в табл, 10, после первого цикла селекции при 0,02 мкМ МТХ в культуральные среды высвобождаются значительные уровни Э ПО.П р и м е р 10, ДНК из клона А -НЕРОЕ13 гидролизуют ЕсоВ 1 и малый фрагмент 5 10 15 20 25 30 35 В 1, содержащий ген ЭПО, субклонируют в ЕсоВ 1-сайт плазмиды ВК 1-4, Эту ДНК (ВКЕ13) затем используют для трансфекции ОНЕ В-отрицательных клеток СНО, а селекцию и амплификацию осуществляют, как описано в примере 9 выше.ДНК ВКЕ 113 также трансформируют в клетки СНО путем слияния протопластов и микроинъекции. Плазмида РКЕ13 депонирована в Агпегсап Туре Сц 1 сцге СоИес 11 оп ВосКч 111 е, Магуапб под номером АТСС 39989.Предпочтительный клон депонирован в Ааег 1 сап Туре Сц 11 цге СоИесбоп ВосМчИе, Магу 1 апс под номером АТСС СРГ 8695.П р и м е р 11, ДН К из рЯЧОО обрабатывают эндонуклеазой Н 1 пд 111 и затупляют с помощью большого фрагмента ДНК-полимеразы 1, Клон ЭПО из фага Л-НЕРОЗ, гидролизуют ЕсоВ и Н 1 пс 111, выделяют фрагмент, размером 4,0 кВ, содержащий ген ЭПО, делают тупыми концы, Фрагмент гена ЭПО вставляют в плазмидный фрагмент рзЧОс 1, Плазмида СЕ 2-1 имеет ген ЭПО в ориентации "а" (т.е. с 5 - концом ЭПО, который ближе к ЯЧ 40) и плазмида СЕ 1 - 3 находится в противоположной ориентации (ориентация "Ь").Плазмиды СЛ 1-3 и С 72-1 трансфекцируют в клетки СОЯ, и среды собирают и анализируют на иммунологически реактивный Э ПО.П р и м е р 12, Плазмиду, содержащую кДНК-последовательность ЭПО под контролем металлотеонинового промотора мышим связанную с полной ДНК вируса бычьей папилломы, получают следующим образом,рЕР 0491Эту плазмиду гидролизуют ЕсоВ 1. и фрагмент ЕсоВ 1 длиной 1340 п,о. из А -НЕРОЕ13 встраивают в нее с помощью ДНК- лигазы. Полученную плазмиду, в которой 5 -конец гена ЭПО является ближайшим к промотору ЯРб, обозначают рЕРО 49 Е, В этой ориентации сайт ВавН 1 в полилинкере РЯ Рб/5 непосредственно примыкает к 5 -концу гена ЭПО. Плазмиду рММТпео ВРЧ обрабатывают ВапН 1. Получают два фрагмента - большой фрагмент размером - 8 кб, содержащий геном ВРУ, и меньший фрагмент размером 6,5 кб. содержащий начало репликации и ген устойчивости к ампициллину, металлотеиониновый промотор, ген устойчивости и неомицину и сигнала полиаденилирования ЯЧ 40 из плазмиды рН 42 ДН К обрабатывают ДНК-лигазой, и плазмиды. которые содержат фрагмент размером 6,8 кб, Одну такую плазмиду обозначают рММТЬео ВРУ.рЕР 015 арММТЬеоВРУ гидролизуют ВдП 1. рЕР 0491 обрабатывают ВавН 1 и ВдО 1, и выделяют фрагмент размером 700 п,о содержащий целую область, кодирующую ЭПО, Плазмиду рММТНео ВР гидролизуют рестриктазой Вд 1 и выделяют фрагмент ВавН 1/Вд 1 ЭПО размером 700 п.о., лигируют и полученные плазмиды, содержащие кДНК ЭПО, идентифицируют гибридизацией при помощи олигонуклеотидного с ООТСАТСТОТССССТОТСС) зонда. Отбирают плазмиду рЕР 015 а, которая содержит кДНК ЭПО, при этом 5 -конец кДНК ЭПО является близлежащим к металлотеоиновому промотору.рВРУ-ЭПОПлазмиду рЕР 015 А гидролизуют ВавН 1 для линеаризации плазмиды. Плазмиду рбВРУ-ММТЬео (342-12) обрабатывают эндонуклеазойВав Н 1, получают два фрагмента размером 6,5 и 8 кб. Первый фрагмент содержит целый геном вируса бычьей папилломы, рЕР 015 а/ВавН 1 и фрагмент ВавН размером 8 кб лигируют друг с другом, и плазмиду (рВРУ-ЭПО), содержащую фрагмент ВПУ, идентифицируют гибридизацией с использованием олигонуклеотидного зонда с 1(Р-ССАСАСССООТАСАСА-ОН). Гидролиз ДНК плазмиды,рВРУ-ЭПО эндонуклеазой подтверждает. что Нпстранск- рипциии генома ВРУ является таким же, как и направление транскрипции металлотеонинового промотора (как в рбВРУ-ММТпео 1342/12. Плазмида рс 1 В РУ-М МТпео/342- 12/ в Авег 1 сап Туре Сц 1 тоге Соестоп БосЕн 111 е, Магц 1 апс под номером АТСС 37224,П р и м е р 13, Получают ДН К плазмиду рВРУ-ЭПО и приблизительно 25 мкг используют для трансфекции 1 х 10 клеток С 127, СНО. Через 5 ч после трансфекции трансфекционные среды удаляют, клетки обрабатывают глицерином, промывают и прибавляют свежую а-среду, содержащую 10 О -ную сыворотку плода коровы, Через 48 ч клетки трипсинизируют и расщепляют в отношении 1:10 в ОМЕ среде, содержащей 500 мкг/мл 6 418, и клетки выращивают в течение двух-трех недель, 6418 - устойчивые колонии выделяют индивидуально в микротитровальную лунку и выращивают до сублизирования в присутствии 6418. Клетки затем промывают, прибавляют свежие среды, содержащие 10;4-ную сыворотку плода коровы, и среды собирают через 24 ч,Клетки С 127 и ЗТЗ трансфецируют 25 мкг рВРУ-ЭПО и 2 мкг рЯЧ 2 пео,Клетки С 127 трансфецируют 30 мкг рВРУ-ЭПО. Вслед за трансфекцией, свежие среды меняют каждые три дня. Приблизительно через 2 недели собирают ВРУ транс формирование клетки в микротитровальные лунки, выращивают и анализируют на активность ЭПО.П р и м е р 14, Плазмидный вектор рИЕУдепонирован в Авепсап Туре Сц 1 твге 10 Соестоп, ВосКне, Магц 1 апс под номером АТСС 3991, Вектор модифицируют следующим образом: рУЕУМ 1 рУЕУ обрабатывают ЕсоЮ для линеа ризации плазмиды, затупляют с использованием большего фрагмента ДНК-полимеразы 1. и лигируют одиночным линкером Кос 20 ООСООССОСС ССОССООСОС Полученную плазмиду обозначают р 1 УКУМ 1, 25 р 1 УЕУ гидролизуют Ива для линеаризации плазмиды, и сшивают с линкером ОООССССАООООССС СССООООТССССООО 30 Полученную плазмиду обозначают рУЕУЯ 1.рУУЕУЯ 1 Вд КрПлазмиду р 1 УЕУЯ гидролизуют Крп 1 для линеаризации плазмиды, и фрагменты размером от 0 до 100 п,о. отщеп ляют от каждого конца путем обработки эндонуклеазой Ва 131. Полученные концы . затупляют с использованием большого фрагмента ДНК-полимеразы 1 и сшивают полилинкером, 40 ХЬо 1 ХЬо 1 Г 11%е 1 песйсеа 1 ко 131АОАТСТСОАОААТТСТАОАТСОАТООТАСС 45 ТСТАОАО СТСТТААСАТСТАОСТАССАТОО Полилинкер встраивают в.обеих ориентациях, Плазмиду, в которой полилинкер ориен тирован таким образом, что сайт Вд 11 внутри полилинкера является близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют рУЕУЯ 1 ВцКр, Плазмиду, в которой сайт Крп 1 внутри полилинкера является 55 близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют рУЕУЯ 1 КрВд. рУЕ/Я 1 ВдКр депонирована в Авегсап Туре Сошге Соестоп, Косине, Магу 1 апб. под номером АТСС 39988,р ЕУЯ 1 Вд КрМ5 10 15 20 25 30 35 40 50 55 рУЕУ М переваривают эндонуклеазами Крп и Рзс. Получают больший фрагмент, который содержит начало репликации и 3 -конец полиэдрального гена, рУЕУЯВцКр гидролизуют эндонуклеазами Рзт и Крп для получения двух фрагментов, Причем меньший фрагмент содержит полиэдральный промотор и полилинкер (фрагмент В). Фрагменты А и В объединяют ДНК-лигазой и получают плаэмиду рУЕУЯ ВцКр М 1.рУЕРОрУЕУ 3 ВО Кр К гидролизуют рестриктазой ЕсоЮ для линеаризации плазмиды, и вс авляют фрагмент Есор размером 1340 п,о. иэ А-НЕРОР13, Плазмиды, содержащие 5-конец гена ЭПО в непосредственной близости к полиэдральному промотору и 3-концу полиэдрального гена, идентифицируют путем переваривания Вд 1. Одну из этих плазмид в ориентации, описанной выше, обозначают как рУЕРО,Экспрессия ЭПО в клетках насекомых Плазмидную ДНК выделяют из Е.соМ 101-1 ф и подвергают дал ьней шей очистке СЯС-центрифугированием. ДНК щтамма - 1 вируса полиэдроза АмоогарЬа сайогпса дикого типа (Асй РУ) получают фенольной экстракцией вирусных частиц и последующей очисткой вирусной ДНК.Эти две ДНК контрасфецируют в клетки Р В-ЯРЯробортего 1 гццрегба, используя методикутрансфекции с фосфатом кальция. Для каждой чашки контрасфецируемых клеток используют ДН К АсКРУ дикого типа и 10 мкг рИЕРО, Чашки инкубируют при 27 С в течение 5 дней. Затем собирают надосадочную жидкость, экспрессию ЭПО в надосадочном слое подтверждают радиоиммунным анализом и биологической пробой и и 1 го.П р и м е р 15. Среды клеток СОЯ(121) с концентрациями ЭПО до 200 мкг/л концентрируют до 600 мл с использованием ультрафильтрационных мембран с молекулярным весом 10000, Концентрированные и диафильтрованные кондиционированные среды содержит 2,5 мг ЭПО в 380 мг общего белка, Раствор ЭПО дополнительно концентрируют до 186 мл, и осажденные белки извлекают центрифугированием при 110000 о в течение 30 мин.Надосадочный слой, который содержит ЭПО (2 мг), доводят до рН 5,5 50%-ой уксусной кислотой, перемешивают при 4 С в течение 30 мин, осадок извлекают центрифугированием при 13000 о в течение 30 мин,Хроматография на карбонилметильнойсефа розе.Отстоявшийся слой, содержащий 200мкг (24 мг общего белка). помещают колонку, с СМ-Сефарозой (20 мл), уравновешенную в 10 мМ ацетатом натрия, рН 5,5,промывают 40 мл того же буферного раствора. ЭПО, связанный с СМ-Сефарозой, элюируют 100 мл градиента Мач (О - 1) в 10 мМрастворе фосфата натрия, рН 5,5. Фракции,содержащие ЭПО (общее количество 50 мкгв 2 мг общих белков), объединяют по группам и концентрируют до 2 мл с использованием ультрафильтрационной мембраны,ВЭЖХ с обращенной фазой,Концентрированные фракции, содержащие ЭПО, подвергают дальнейшей очисткеВЭЖХ с обращенной фазой, используя ко- .лонку Чубас С. ЭПО подают на колонку,уравновешенную в 10%-ом растворителе В(Растворитель А представляет собой 0,1%СРЗСО 2 Н в воде; растворитель В представляет собой 0.1% СРзС 02 Н в СЕЗС ), с низкойстепенью подачи 1 мл/мин. Колонку промывают 10% в в течение 10 мин и ЭПО элюируют линейным градиентом В (10 - 70% втечение 60 мин), Фракции, содержащиеЭПО, объединяют по группам (-40 мкг ЭПОв 120 мкг общих белков) и лиофилизируют,Лиофилизованный ЭПО повторно структурируют в 0,1 М растворе Тгз-НС при рН 7,5,содержащем 0,15 М КаС, и повторно хроматографируют ВЭЖХ с обращенной фазой.Фракции. содержащие ЭПО. объединяют погруппам и анализируют электрофорезом вЮЯ-полиакриламидном (10%) геле. Объединенные фракции ЭПО содержат 15,5 мкгЭПО в 25 мкг общего протеина.Формула изобретения1,Способ получения человеческогоэритропоэтина, предусматривающий культивирование штаммов эукариатических клеток, выделение и очистку целевого продуктапутем концентрирования, осаждения, центрифугирования и афинной хроматографии,о т л и ч а ю щ и й с я тем. что, с цельюповышения активности эритропоэтина. предварительно конструируют рекомбинантныеплазмидные ДНК. обеспечивающие синтезэритропоэтина, путем клонирования фрагмента ДН К. кодирующего эритропоэтин