Векторная плазмидная днк ртк 1261, предназначенная для интеграции чужеродного фрагмента в геном вируса осповакцины, и способ ее конструирования

(51)5 С 12 Ы 15/ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Изобре еской ин онкретно ВОВ штамма ледовательность ТК-ге ЛИВП с полилинкером в Плазмидная ДНК рТ 3574 н.п. состоит из векторной части в фрагмента ДНК плазм длиной 2313 н.п., со устойчивости к ампиц ве гене тиче ско го мар фрагмента генома кодирующего последовви него61 раз ом вируса осп Целью и рение выбо чужеродного в составе Т Сконстру плазмида рТ ную часть, чц 11 виде С 1 а 1- ид 1 рВК 322 Ье ржаще го г иллину в ка ера;,ОВ штамма Л тельность ИВП К-г ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬПИЯМ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной бислогии (72) Г. Г,Приходько, И. Х.Урманов, О.И.Серпинский, Н,Н.Микрюков и В.Е,Чижиков(53) 575.224.2:577,2(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР У 1354709, кл. С 12 И 15/00, 1985. (54) ВЕКТОРНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рТК 1261, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ИНТЕГРАЦИИ ЧУЖЕРОДНОГО ФРАГМЕНТА В ГЕНОМ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ, И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ(57) Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой рекомбинантную плазмиду, обеспечивающую интеграцию чужеродного генетического материала в геном вируса осповакцины (ВОВ) штам ма ЛИВП. Целью изобретения является расширение выбора стратегии клонирования чужеродного генетического матеение относится к генетинерии и биотехнологии, получению рекомбинантов вакцины (ВОВ).обретения является расшира стратегии клонированиягенетического материала К-гена ВОВ штамма ЛИВП. ирована рекомбинантная К 1261, содержащая вектора также нуклеотидную пос-. 2риала в составе ТК-гена вируса осповакцины штамма ЛИВП. Новая плазмидная ДНК рТК 1261 состоит из фрагментов генома ВОВ штамма ЛИВП, расположенных на расстоянии 142-736 н.п, и 769" 1379 н.п. от Ндпй 111-сайта рестрик ции К-фрагмента генома ВОВ, слитого полилинкера плазмид 1285 и рПС 18 длиной 56 н.п., содержащего уникальные сайты рестрикции С 1 а 1, Нпй 111, БрЫ, Рзс 1, Яа 1 С 1, ХЬа 1, Ваш Н 1, Бша 1, Крп 1, Бас 1, Есо К 1 и векторной части в виде С 1 а 1-Рчц 11 фрагмента ДНК плазмиды рВК 322 ц, Предложенная векторная конструкция позволяет расширить стратегию клонирования чужеродного генетического материала в составе ТК-гена ВОВ штамма ЛИВП. Полученная генно-инженерная субстанция харак. теризуется на способность интегриро" вать в геном ВОВ чужеродный генетический материал, например ген 7 Р 1 вируса гепатита А штамма НАБ 15 с поздним промотором ВОВ Р , 2 с.п. ф лые. уникальных сайта с постферментативным5Формированием 3 "концевых участковДНК (ССАТС С, ССТАСС и САССТС).Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рТК 1261 включаетв себя;10гидролиз плазмидной ДНК рТК 1285рестриктаэами Н 3.пй 111 и Есо К 1 с целью частичного удаления полилинкераплазмиды;гидролиз плазмидной ДНК рПС 18рестриктазамин НЫЙ 111 и Есо К 1 сцелью выделения полилинкерной ДНК;лигирование линеаризованной плаэмипы с целью получения целевой плаэ"мидной ДНК рТК 1261.20Способ конструирования позволяетввести полилинкер с уникальными сайтами расщеплечия ферментов С 1 а 1,НЫИ 111, ЯрЫ, Яа 1 С 1, ХЬа 1, Ваш Н 1,Яша 1, Крп 1, Яас 1 и Есо К 1 внутри 25ТК-гена.Сущность изобретения заключается втом, что для интеграции чужеродногогене тиче ско го материала в геном ВОВконструируют плаэмидный вектор, содержащий ТК" ген с прилегающими районами Нь.пй 111-. К-фрагмента ДНК ВОВ иуникальные сайты рестрикции НЫЙ 111и Есо К 1, по которым клонируют полихынкер. Искусственно введение 10уникальных сайтов рестрикции используют для клонирования чужеродных генов, которые методом котрансфекцииинтегрируют в ДНК ВОВ,П р и м е р 1. Конструированиевекторной плазмидной ДНК рТК 1261.5 мкг плазмидной ДНК рТК 1285 подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции Нхпй 111(5 е.а.) и Есо К 1 (5 е.а.) в 10 мИтрис-НС 1, (рН 7,5) и 10 мИ 2-меркаптоэтанола; 50 Им ИаС 1, 10 мИ ИяС 1при 37 С 60 мин, как описано. После0тепловой денатурации белков при 65 Св течение 20 мин продукты ДНК разделяют электрофорезом в 43-ном полиакриламидном геле (ПААГ) и выделяютбольший Фрагмент ДНК.20 мкг плаэмидной ДНК рПС 18 расщепляют ферментами Нпй 111 и,Есо К 1,55как описано, и выделяют Ндпй 1 ПЕсо К 1-полилинкер из 87-ного ПААГ.Линеариэованную плазмидную ДНКрТК 1285 Нхат 111 Есо К 1 и Ный 1114 Есо К 1-полилинкер сшивают ДНК-лигазой Фага Т 4 (1 е.а.) в 50 мИ трисНС 1, рН 7,5; 0,5 мИ АТР, 10 мМ 2-мерокаптоэтанола, 5 мМ И 8 С 1 при 8 С12 ч. Препарат ДНК осаждают спиртом.1/10 часть ДНК трансформируют вкомпетентные клетки штаюа Е,со 11НВ 101, Пдазмидную ДНК (рТК 1261)выделяют щелочным методом из положительно гибридизующейся п здп колонии Е.со 1 и подвергают рестрикционному анализу. Структуру полилинкераподтверждают секвенированием ДНК отС 1 а 1-сайта рестрикции методом ИаксамаГилберта.П р и м е р 2. Получение рекомбинантного ВОВ, содержащего ген ЧР 1вируса гепатита А штама НАЯ 15,Плазмидную ДНК рТК 1285-Р -ЧР 1 НАЧ расщепляют рестриктаэами Ваш Н 1и Есо К 1 в стандартных условиях, Сконцевую часть гена ЧР 1 ВГА выделяютиз 42-ного ПААГ и сшивают с Ваш Н 1 Есо К 1 линеаризованной плазмидойрТК 1261 с помощью ДНК-лигазы фагаТ 4. Лигаэной смесью трансформируюткомпетентные клетки штамма Е.со 1 хНБ 101 и отбирают колонии ДНК-ДНКгибридизацией. Рекомбинантные молекулы ДНК (рТК 1261"СЧРХ-НАЧ) анализируют рестриктазами Ваш Н 1, Рчц 11 иЕсо К 1,Плазмидную ДНК рТК 1285-Рц -ЧР 1 НАЧ гидролизуют эндонуклеаэами рестрикции С 1 а 1 и Ваш Н 1. Выделяют меньшийфрагмент ДНК, содержащий поздний промотор Р ВОВ и И-концевую часть генаЧР 1 БГА и сшивают с С 1 а 1-Баш Н 1 линеаризованной плазмндой рТК 1261 СЧР 1-НАЧ, Отбирают рекомбинантныемолекулы ДНК (рТК 1261-Р -ЧР 1-НАЧ)и анализируют рестриктазами Есо К 1,Ря 1 Ваш Н 1 и С 1 а 1.ДНК плазмиды рТК 1261-Р, -ЧР 1-НАЧиспользуют для трансформации клетокпочки зеленой мартьшпи СЧ 1, заражен"ных ВОВ штамма ЛИВП. Урожай вирусапосл трансформации высевают на мо"нослой перевиваемой линии клетокН 143. В присутствии 25 мкг/мл бромдезоксиуридина отбирают вирусные ТКклоны. Методом ДНК-ДНК-гибридизациипроверяют наличие генаЧР 1 ВГА вклонах. Вирусную рекомбинантную ДИКвыделяют, как описано, и подвергаютанализу рестриктазой Нпй 111,Таким образом, сконструирован новый плаэмидный вектор рТК 1261, име-Предлагаемое техническое решение может найти применение при создании генно-инженерных живых вакцин на основе ВОВ. Формула изобре тения Составитель Е, КузнецоваРедактор И.Дербак Техред Л,Олийнык Корректор С,йекмар Заказ 997 Тираж 386 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 ющий расширенный состав сайтов рестрикции внутри ТК-гена ВОВ (С 1 а 1,Нпй 111, ЯрЫ, Рзт 1, Яа 1 С 1, ХЬа 1Ваш Н 1, Яша 1, Крп 1), что позволяетклонировать чужеродную ДНК без АТСкодона с помощью коннекторного способа 1 в отличие от известного). На примере гена ЧР 1 вируса гепатита А продемонстрирована возможность использования плазмиды рТК 1261 для получения вирусных рекомбинантов. Векторная плазмидная ДНК рТК 1261, предназначенная для интеграции чужеродного фрагмента в геном вируса осповакцины размером 3574 н.п., содержащая:Фрагменты ДНК рВК 322, имеющие последовательности, соответствующие координатам 3-28 н.п. и 2968-4357 н,п., последний из которых с геном устойчивости к ампициллину;фрагменты ДНК вируса осповакцины, расположенные на расстоянии 142- 736 н,п. и 769-1379 н.п, от НМ 1 П- сайта рестрикции К-Фрагмента генома ВОВ штамма ЛИВП, кодирующие И- и 0163 6С-концевые части ТК-гена соответственно;С 1 а 1 - Н 1 пд 111- и Ндпй 111 - Есо К 1 -Фрагменты ДНК плаэмид рТК 1285 ирПС 18 длиной 6 и 50 н,п. соответственно с участкамп узнавания рестриктаз С 1 а 1, Нпй 111, ЯрЬ 1, Рзс 1, Яа 1 С 1,ХЬа 1, Ваш Н 1, Яша 1, Крг 1, Яас 1,Есо К 1;участок инциации трансляции: АТСкодон в последовательности ССАТСС;сайты рестр:кции с постферментатив"ным Формированием 3 -выступающих концов: ЯрЬ 1, Рвг.1, Крп 1, Яас 1;уникальные сайты рестрикции С 1 а 1,НЫЙ 111, ЯрЫ, Яа 1 С 1, ХЬа 1, Ваш Н 1,ЯшаЕ, Крп 1, Яас 1 и Есо К 1;генетические маркеры плазмиды:20 ашр " - устойчивость к ампициллинуемкость от 100 до 1,4 тыс. н.п.;штаюы-хозяева; штгммы Е.со 1 дс 1 аш-фенотипа,2. Способ конструирования вектор 25 ной плазмидной ДНК рТК 1261 для получения рекомбинантов вируса осповакцины, заключающийся в том, что совместным гидролизом рестриктаэ Ндпй 111и Есо К 1 гдлучают линеризованнуюплазмиду рТК 1285 Н па 111 Есо К 1и полилинкерную ДНК плазмиды рБС 18размером 50 н,п которые сшивают спомощью ДНК лигазы фага Т 4 и получают целевую векторную плазмиду рТК1261.35