Способ получения индоксильных или тиоиндоксильных сложных эфиров аминокислот или пептидов

%(51) С 07 Э 209 ОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТ ССО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦ РЕТЕНИ АНИЕ ИЗ ксильную, аралкоксикарбонильную, аралкокснкарбонил (низший) алкоксильную, нитро- или низшую ациламиногруппу, или два соседних заместителя означают бензоаннелированный остаток;- сера или незамещенная иминогруппа или замещенная алкильным, аралкиль 3-0 3-0 Бюл. У 18гер, Франц Браун,Манфред Куррнер (ФРГ)Маннхайм ГмбХ (ФР(088.8)Н Пирсон Д. ОргМ., "Мир", 1973 ным, а ным ос па; моноам лота и боновая киснинсодержащийпепт ный о нокар и ала и ди- ил три- идтаток;В - И-защитная группатидной части (остчающий с я тем,ие общей формулы 11(54)(57) СПОСОНЫХ ИЛИ ТИОИНДРОВ АМИНОКИСЛОформулы 1 ПОЛУЧЕНИЯ ИНДОКСИЛЬСИЛЬНЫХ СЛОЖНЫХ ЭФИИЛИ ПЕПТИДОВ общей пепке),о т л сое где К -Кеи Хподвергаютгидридами ил имеют указанны заимодействию значения- одинаковые или разл и означают водород, ид, низшую, алкильну с галоиданнгидридами, ыми эфирами гало, али смешанными ванными слож формулы 111 О-А-В и активиро слот общей коксильную, арильную, кнльную, аралкоксильну гицроксильную, карбокс ную, карбокси (низший) иль. алка е А и В имеют указанны начения. Н ПАТЕНТУ(72) Дитер БерВернер Гютляйни Вольфганг Ве(56) 1, Бюлерческие синтезьч, 2, .гл. 14,СОЮЗ СОВЕТСНИСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИН ильным или ацил тком,иминогруп1156595 17 ся. Составитель И. БочароваРедактор О, Колесникова Техред С.Мигунова 1(орректор М, Демчик Заказ 3202/57 Тираж 384ВНИИПИ Государственного комитета СССР/по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 лагаемого диагностического средстваохватываются интактные и лизированные лейкоциты, так как активность лейкоцитных протеаз также после лизиса лейкоцитов полностью сохраняетИзобретение относится к области получения новых сложных эфиров аминонокислот или пептидов, которые могут быть использованы в качестве диагностических средств. 5Известно получение сложных эфиров взаимодействием спиртов с галоидангидридами кислот, смешанными ангидридами или активированнь:ми слож. ными эфирами кислот 1, 1 ОЦель изобретения - разработка на основе известного метода способа получения новых соединений для быстрой и простой диагностики,Поставленная цель достигается способом получения индоксильных илитиоиндоксильных сложных эфиров аминокислот или пептидов общей формулы 20 КК -Н - одинаковые или различные 25 1 4.и означают водород, галоид, низшую алкильную,алкоксильную, арильную,аралкильную, аралкоксильную, гидроксильную, кар- ЗОбоксильную, карбокси(низший) алкоксильную,аралкоксикарбонильную,аралкоксикарбонил (низший) алкоксильную, нитро- или низшую ациламиногруппу, или два соседних заместителя означаютбензоаннелированный остаток; 40Х - сера, или незамещеннаяаминогруппа, или замещенная алкильным, аралкильным, арильным или ацильным остатком аминогруппа;5А - моноаминокарбоновая кислота или аланинсодержащий дк- или трипептидныйостаток;В - И-защитная группа в пе- утидной части (остатке), асно которому соединение общей где мулы й,2 ОНКН где К,-К и Х имеют указанные значения, подвергают взаимодействию с галоидангидридами или смешанными ангидридами, или яктинированными сложными эфирами кислот общей ФормулыНО - А - Вгде Л и Р. имеют указанные значения,В качестве обычной в химии пептидов защитной для азота группыв определении В нужно понимать, например ацильную, оксикарбонильную,тиокарбонильную, сульфонильную, сульфенильную, линильную, циклогексецильную, Фосфорильную или карбомоильнуюгруппы,П р и м е р 1, 3-/И-/Толуол сульфонил/-1: аланилокси/-индол,Раствор 1. Для приготовления хлорангидрида кислоты по одностадийномуспособу 5,35 г (0,22 моль) И-/толуол-сульфонил/-1,-аланина растворяют в 20 мл абсолютного диметилформамида (ДМФ) и охлаждают до -30 С, Затем при перемешивании и охлаждениидобавляют пипеткой 1, 76 мл (0,024 моль)хлористого тионила и реакционнуюсмесь оставляют на 30 мин в охлаждающей бане при -30 С,Раствор 2, В трехгорлую колбуемкостью 250 мл, снабженную мешалкой, термометром и трубкой для подачи и отвода газа, вносят после полного удаления воздуха за счет слабоготока азота раствор 2,90 г (0,022 моль)индоксила (3-окси-индола) в 40 млабсолютного ДИФ, добавляют 9,74 млабсолютного пиридина и охлаждаютдо -15 С,Взаимодействие. Приливают раствор 1 к раствору 2 и перемешиваютв отсутствие кислорода и влаги примерно в течение 5 ч при -15 С до техпор, пока с помощью тонкослойнойхроматографии нельзя более обнаружить индоксил.Для обработки реакционную смесь концентрируют в вакууме максимально при температуре бани 40-50 С. Остаток растворяют в 100 мл уксусного эфира и промывают последовательно дважды по 30 мл 1 н. раствора лимонной кислоты, 20 мл воды, 50 мл 5%-ного раствора бикарбоната натрия и. 25 мп воды, Уксусноэфирную фазу после высушивания над сульфатом натрия выпаривают в вакууме,з 1156595 4Полученный сырой продукт очищают кристаллы т,пл, 138 С (2-28 0фс помощью колоночной хроматографии с = 1 Е (метансл); на силикагеле смесью толуола с диок,9 3-/И-/бензилоксикарбонил/-Ь - саном (9;1). После отгонки раствори- аланилокси/-6-хпор-чндол бесцветтеля из собранных Фракций в вакууме 5 ные кристаллы т,пл 170 С го:фф Л благодаря замешиванию остатка в эфи- -41,3, с = 1 Х (метанол); ре получают 1,45 г (18,4 Е) 3-И-/то.10 3-/Я-/толуол-сульфонил/-Ьлуол-сульфонил/-Ь-алакилокси/-ин- , аланилокси/-4-хлор-бром-индол, дола, бесцветные кристаллы, т.пл, бесцветные кристаллы, т,пл. 150- 103 С; Ы : -56,6, с = 17 (метанол) 10 152 С о.р -31,0, с = 1 Х (метанол)фВ качестве побочного продукта из 1 11 3-/И-/толуол-сульфонил/-Ь- других фракций указанного отделения аланилокси/-4,5,7-трихлориндол; с помощью колоночной хроматографии 1, 12 3-/И-/толуол-сульфонил/-Ьеляют еще 0 8 9 г ( 1 1 3 У ) 1 / Д / ала нилок си/-4-хлоР-бР ом-метилтолуол-сульфонил/-Ь-аланилокси/-3- 15 индол; слабо окрашенные в бекевый 3оксииндола-/М/толуол-сульфо- цвет кристаллы, т.пл. 143-145 С; нил/-Ь-апанилокси/-"1-сксоиндолина ТХ: готовая пластина (Рег 1 др 1 аСского эфира: бесцветные кри-е) иликагеля элюирующе средство сталлы, т. л. 187-188 Сф г;41,7, толуол:диоксан 2:1 индикация: УФФ с = 1 Х (ДМФ), 20 ИН,(газ), КГ-значение 0,56,/Аналогично путем взаимодействия 1 13 3-/М-/Толуол-сульфонил/-Ь- замещенных индоксильных соединений аланилокси/5-окси-индолф с соответствующими аминокислотами1,14 3-/И-бензилоксикарбонил/-Ь-елаполучают следующие субстраты причем нилокси/5-метокси-индол;Эво всех случаях (кроме 7.23-7 27) 25 1. 15 3-/И-/толуол-сульфонил/-Ь - в качестве побочных продуктов обра- аланилокси/-5-бенэилокси-индол9 зуются указанные 1-замещенные 3-окси16 3-/М-/толуол-сульфонил/-Ь -индольиаланилокси/-4-карбокси-индол;1 1 3-/Я-/бенэолоксикарбонил/-Ь-аланилокси/-индол, бесцветные кристал- ЗО аланилокси/-4-бензилокси-карбониллы, т.пл, 123 С; о"- 49,0,с = 17индол;(метанол).ТХ: готовая. пластина силикагеляэлюирующее средство толуол-диоксан4: 1, индикация: УФ, МН,(газ), КГзначение 0,19,1.46 3-/Я-/Бензилоксикарбонил/-Ьаланнл,-аланил-Ь-аланилокси/-индол,бесцветные кристаллы, т.пл. 156 С;оу ; -39,5, с = 1 Х (метанол);1,47 3-/И-/толуол-сульфонил/-Раланил-П-аланил-Ь-аланилокси/-индол,бесцветные кристаллы, т,пл, 216 С;Ы, +53,8, с = 1 Ж (метанол);1.48 3-/И-/ацетил-Ь-аланилокси/-индол, бесцветная аморфная пена;-12,5, с = 17 (метанол),ТХ: готовая пластина силикагеля (элюирунищее средство уксусный эфирдихлорметан 10: 1, индикация: Уф, ИН (газ), КЕ - значение 0,33.1.49 3-/Я-Сукцинил-Ь-аланилокси/- индол, бесцветные кристаллы, т,пл, 142 С; св . -63,9, с = 1 Ж (метанол);1,50 3-/И-бензоил-Р, Ь-аланилокси/- индол, бесцветные кристаллы, т,пл, 171 С;Ь Ц1.51 3-/Я-фталоил-Ь-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл, 58 С с : -26,3, с = 1 Х (метанол), 1.52 3-/И-/этоксикарбонил/-1.-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т,пл. 96 С; е(, . -68,9, с = 1 Х (метанол).1,53 3-/И-/циклогексилоксикарбонил/- Ь-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллй, т.пл. 149 С о: -60,4, с = 1 Х (метанол);1,54 3-/К-/феннлоксикарбонил/-Е-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т,пл, 161 С; о : -96,0, с = 1 Е (метанол); 1,55 3-/К-/4-метил-бензилоксикарбонил/-Ь-аланилокси/-индол,1 10 бесцветные кристаллы, т,пл. 135 С; а . -45,9, с = 17. (метанол)1.56 3-/К-/4-нитро-бензилоксикарбонил/-Ь-аланилокси/-индол, желтоватые кристаллы, т,пл. 160 С;,ф: -29,4 С, с = 17 (метанол).1,57 3-/К-/бензилтиокарбонил/-Е-аланилокси/-индол бесцветные кристаллы, т.пл. 122 С; о о: -77,8, с = 17 (метанол);1.58 3-/К-метансульфонил/-Е-алани 20 локси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 164-166 С; с 2: -54,0, с = 17 (метанол);1.59 3-/К-/бензилсульфонил/-1.-ала.нилокси/-индол, бесцветное вязкое25 масло; с: -54,8, с = 17 (метанол).ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол-уксусный эфир 2;1, индикация: УФ, КН,(газ), Ы - значение 0,40, 30 1,60 3"/К-Бензолсульфонил/-Е-аланилокси/-индол, бесцветное вязкое масло; Ы 1 . -59,8, с = 1 Х (метанол).ТХ; готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол" - уксус ный эфир 2; 1, индикация, УФ, ИН (газ), КГ - значение 0,48.1.61 3-/К-/4 -Бром-бензилсульфонил/- Ь-аланилокси/индол, желтоватый аморфный порошок, ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуолдиоксан 4:1, индикация: УФ, КН (газ) КГ - значение 0,39.1.62 3-/К-/4 -Нитро-бензолсульфонил/- Ь-аланилокси/-индол, бесцветные кри сталлы, т.пл. 136-137 С; с:-35,9, с = 13 (метанол);1.63 3-/К-/4 -ацетиламино-бенэолсульфонил/-1,-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 162-163 С; Ы: ЗФ -57,2, с = 1 Х (метанол);1.64 3-/К-/4 -н-бутил-бензолсульфонил/-1.-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 105 С; а 1, -46,1, с = 1 Х (метанол). 55 1.65 3-/К-/4 -трет-бутил-бензолсульфонил/-Ь-.аланилокси/-индол, бесцвет. ные кристаллы, т.пл. 140 С; ;-40,3, с = 17 (метанол);1,70 3-/К-/4 -/2 окси-этокси/-бенэолсульфонил/-1.-аланилокси/-индол1.71 3-/К-/4 -/3" -окси-оксн-нпентилокси/-бензолсульфонил/-1-аланилокси/-индол бесцветное вязкоеУмасло; с. -36,4, с = 1 Х (метанол).ТХ: готовая пластина силикагеля,элюирующее средство толуол - этилацетат 1:10, индикация: УФ, КН,(гаэ),КЕ - значение 0,37,1.72 3-/К-/4 -/3", 6-Диокси-н-гептилокси/-бенэолсульфонил/-1,-аланилокси/-индол, слабо красноватое вязкое масло; ТХ: готовая пластина силнкагеля, элюирующее средство толуолдиоксан 4:1, индикация: УФ, КН (газ)И - значение 0,21,1,73 3-/К-/4 -/2-Окси-зтил/-бензолсульфонил/-1.-аланилокси/-индол, желтоватьпЪ, аморфный порошок; Ы = -54,5с = 13 (метанол).ТХ: готовая пластина силикагеля,элюирующее средство: толуол - этилацетат 1:2; индикация: УФ, КН (гаэ),КЕ - значение 0126.1.74 3-/И-/2 -/4" -Нитро-бенэилокси/этил/-бензолсульфонил/-1,-аланилоксииндол;1.75 3-/К-/4-/2"-хлор-этил/-бензолсульфонил/-1.-аланилокси/-индол, слабо красноватая аморфная пена;:/аланилокси/-5-фенил-индол. Н р и и е р 2, 3-/И-/трет,-бутилокспкарбонил,/-1,-аланилокси/-ичдол.Для взаимодействия по карболиимидному способу 3,23 г (0,017 моль),И-трет,-бутилоксикарбонил,-аланинаи 2,27 г (0,017 моль) индоксила растворяют н 100 мл смеси абсолютногодиоксана-лихлорметана 1:. После добавки раствора 3,87 г (0,019 моль)1дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) в20 мл абсолютного диоксана перемешивают н течение 68 ч при комнатнойтемпературе в отсутствие влаги и кислорода, Выделившуюся И,И -дициклогексилмоченину отсасывают, растноритель отгоняют н вакууме и остатокрастворяют примерно н 100 мл этилацетата, После отсасывания следующего количеств," выделившейся И,И -дициклогексилмоченины прозрачныйэтилацетатный раствор последовательно промывают по дна раза 30 мл 1 н,лимонной кислоты, 20 мл воды, 50 мл5-10%-ного раствора бикарбоната натрия и 25 мл воды, После высушиваниянад сульфатом натрия этилацетатнуюфаэу концентрируют н вакууме, Аморфный остаток очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагелес помощью смеси толуол-диоксан(9:1),После концентрирования собранныхФракций в вакууме и перекристаллизации остатка из смеси уксусногоэфира и эфира (1:1 О) получают 1,04 г(20%) 3-/И/-трет-бутилоксикарбонил/Ь-аланилокси/-индола: бесцветныекристаллы, т,пл, 158 С; : -65 0,с = 1% (метанол),В качестве побочного продукта приэтом взаимодействии также образуется замещенный н 1-положение 3-оксииндол (см, пример 7),Аналогично получают путем взаимодействия соответственно замещенныхиндоксильных соедчнений с соответствующими аминокислотами следующие субстраты, причем также здесь во всехслучаях в качестье побочных продуктов образуются соответствущие замеУщенные в 1-положение 3-оксн-индолы;2.1 3-/И-формил-Ь-аланилокси/-индел,бесцветные кристаллы, т.пл, 121122 С; о( 1, . -2,5 , с = 1% (метанол);2,2 3-/И-/4 -бензилоксикарбонил/-1. -аланилокси/-индол, бесцнетяые кристаллы, т,пл, 92 С; и",: -4,9,с = 1% (метанол);-аланилокси/-индол аморфный, сла 10бо красноватый порошок, ТХ: готоваяпластина силикагеля, элюирующее средство толуол - диоксан 4;1, индикация: УФ, ИН,(газ), ВГ - значение 0,23.2,6 3-/М-/Дифенилкарбамоил/-Ь-алани 15локси/-индол, бесцветные кристаллы,т,пл. 188-190 С, с : +22,2, с = 17.(пиридин).П р и м е р 3. 3-/М-/фурил"2 -20метоксикарбонил/-Ь-аланилокси/-индол,Для взаимодействия по способу активного сложного эфира 4,26 г(0,02 моль) И-/фурия/-метоксикарбонил/-Ь-аланина и 5,4 г (0,04 моль)М-окси-бенэотриазола растворяют в50 мл абсолютного тетрагидрофурана(ТГФ), охлаждают до 0 С и смешиваютс раствором 4,4 г (0,022 моль) дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) в 10 млабсолютного ТГФ. Для образования активного сложного эфира реакционнуюсмесь перемешивают 1,5 ч при 0 С, затем 2 ч при комнатной температуре.Затем в отсутствие влаги и кислородадобавляют 2,66 г (0,02 моль) индокси ла и 2,77 г (0,04 моль) абсолютноготриэтиламина. Смесь перемешивают втечение 18 ч при комнатной температуре. Образовавшуюся И,М -дицикломочевину отсасывают, растворитель отгоняют в вакууме и остаток обрабатываютпо примеру 7, Аморфный сырой продукточищают с помощью колоночной хроматографии на колонке с силикагелемс помощью смеси толуол - уксусный Мэфир (5: 1). После концентрированиясоответствующих собранных фракцийи перекристаллизации из смеси уксусного эфира с петролейным эфиром (1:1)получают 3,0 г (45,7 Ж) 3-/М-/фурил Ф/2/-метоксикарбонил/-Ь-аланилокси/- индола бесцветные кристаллы, т.пл.129 С; с 1, -51,9., с = 17 (метанол)Аналогично взаимодействием соответственно замещенных аминокислот ,55или пептидов с соответствующими ичдоксильными соединениями получают следующие вещества: 3. 1 3-/И-/толуол-сульфонил-Ь-валилокси/-индол, бесцветнее кристаллы,т пл. 125-127 С;гр" . -24 5с = 1 Х (метанол);3.2 3-/М-/4 -диметиламино-бензолсульфонил/-Ь-аланилокси/-индол; аморфныйслабо красноватый порошок; ТХ: готовая пластина силик, геля, элюирукщеесредство толуол-диоксан 3:1, индикация: Уф, ИН,(гаэ), КЕ - значение 0,25 ф3,3 3-/И-/4 -ацетил-бензолсульфонил/Ь-аланилокси/-индол;3,4 3-/М/4 -метоксикарбонил-бензолсульфонил/-Ь-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл, 140-141 С;с г;: -40,3, с = 1 (метанол);3.5 3-/М-/4 -карбоксиметил-бензолсульфонил/-Ь-аланилокси/-индол, аморф ная бесцветная пена; с 1 г 1 : -82, 1,с = 12 (метанол), ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средствоизопропанол-н-бутилацетат-вода5:3;2, индикация: УФ, ИН,(газ),КГ - значение 0,68,3,6 Э-/И-/4-карбоксиметокси-бенэолсульфонил/-Ь-аланилокси/-индол,аморфная бесцветная пена,с . -47,7,с = 17 (метанол),.ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средствотолуол-диоксан-ледяная уксуснаякислота 6:2:1, индикация: УФ,МН,(гаэ), КГ - значение 0,27;3,7 3-/И-/4 -карбоксиметиламино-бензолсульфонил/-Ь-аланилокси/-индол,бесцветные кристаллы, т.пл. 151153 С (разложение);о р . -71,5,с = 1 Ж (метанол)3,8 3-/М-/4 -бензилоксикарбонил-метиламино/-бензолсульфонил/-Ь-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 110-113 С; сЕ: -60,0,с = 13 (метанол);3,9 3-/И-/4 -фтор-бензолсульфонил/Ь-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллыф г пл 94 95 Сф 148 ф 5 фс = 1 Х (метанол);3.10 3-/М-/4 -фторсульфонил-бензолсульфонил/-Ь-аланилокси/-индол93. 11 Э-/М-/4 -сульфамоил-бенэолсульфонил/-Ь-аланилокси/-индол;3. 12 3-/М-ацетил-И-/толуол-сульфонил/-Ь-аланилокси/-индол, бесцветный аморфный порошок; о: -10,6,с = 1 Ж (метанол),ТХ: готовая пластина силикагеля,элюирующее средство толуол-диоксана9:1, индикация: УФ, ИН,(газ), ВГ -значение 0,17.,15аланилокси/-5-метокси-индол;бесцветное вязкое масло; о: -46,8,с = 1% (метанол),ТХ: готовая пластина силикагеля,элюирующее средство толуол-этилацетат2: 1, индикация: УФ, ИН,(газ), КГ -значение 0,45.П р и м е р 4, 3-/И-/3, 6-Диокса-н-гептилокси-карбонил/-Ь-аланилокси/-индол.Для взаимодействия по способу смешанного ангидрида 3,52 г (0,015 моль)-И-/3,6-диокса-н-гептилокси-карбонил/-Ь-аланина растворяют в 35 млабсолютного тетрагидрофурана (ТГФ).После добавки 2,1 мл (0,015 моль)триэтиламина смесь охлаждают до-15 С, затем для получения смешанного ангидрида смешивают с 1,43 мл"15 С в отсутствие кислорода и влагидобавляют охлажденный до "15 С раствор 2,00 (0,015 моль) индоксила в20 мл абсолютного ТГФ. Смесь перемешивают следующие 2 ч при (-15 С) - 40(-20 С) и затем оставляют на ночьв холодильнике, Отсасывают образовавшийся триэтиламиногидрохлорид,растворитель удаляют в вакууме и остаток обрабатывают по примеру 7, 4 фАморфный сырой продукт очищают с помощью колоночной хроматографии насиликагеле сначала смесью .хлористыйметилен метанол (95:5), затемсмесью толуол - металатилкетон (1;2), фПосле обработки собранных фракцийактивным углем и удаления растворителя получают 0,51 г (9,57) 3-И-(3,6 -диокса-н-гептилокси-карбонил/-1, -аланилокси/-индола, бесцветного вязкого масла; Ы : -40, с =. 17 (метанол); ТХ: готовая пластина силикагеЛя, элюирукицее средство толуол-метилэтилкетон 1:2, индикация: УФ,ИН,(газ), КГ - значение 0,54,Аналогично взаимодействием соответственно замещенных аминокислотс соответствующими индоксильными соединениями получают следующие вещества:4,1 3-/И-нитро-бензолсульфенил/Ь-аланилокси/-индол желтые кристаллы, т,пл. 133-134 С; с: -116,0,с = 17 (метанол);4.2 3-/И-/1 -метил-бензоил-винил/Ь-аланилокси/-индол, слабо красноватые кристаллы, т.пл, 130-133 С; ТХ:готовая пластина силикагеля; элюирующее средство толуол-диоксан 4;1,индикация: УФ, ИН,(газ), КЕ - значение 0,45.Соединения формулы 1 служат дляполучения диагностичных средств дляобнаружения протеолитических ферментов, в особенности в жидкостях организма. Эти средства позволяют быстрои просто проводить диагностику.Данные о свойствах полученных соединений, В качестве хромогенов индоксильные или тиоиндоксильные сложные эфиры аминокислот и пептидов общей формулы 1 используются в концентрациях 10 - 1 моль/л, предпочтитель-2но 10 - 1 О моль/л пропиточного раствора, наносимой массы или исследуемой жидкости.Другой составной частью диагности" ческого средства для обнаружения протеолитических ферментов, в особенности протеаз лейкоцитов, является пригодная буферная система, например фосфатный, боратный, барбитуратный, трис-/оксиметил/- аминометановый -трис-/2-амино-метил-пропандиол,3-овый/=/амедиоловый/ или аминокислотный буфер, причем рН и объем нужно выбирать так, чтобы в измеряемом растворе или на тест-полосах устанавливалось рН 6-10, предпочтительно 7-9.При приготовлении диагностического средства для обнаружения протеолитических ферментов, в особенностизлейкоцитных протеаз в жидкостях организма, можно дополнительно применять окислитель, чтобы превращать первично образующиеся при ферментативной реакции индоксильные или тиоиндоксиль. ные соединения в окрашенные индигоили тиоиндиго-вещества, Эти окислители, например гексапианоферрат-(111)Диагностическое средство для обнаружения протеолитических ферментов, в особенности лейкоцитных протеаз, в форме порошкообраэных смесей 5 или таблеток реактивов можно изго"товлять так, что указанные составныечасти теста смешивают с обычными галеновыми добавками и гранулируют,Добавками такого рода являются, 0 например, углеводы, например моноУолиго- или полисахариды, или сахарные спирты, например маннит, сорбитили ксилит, или другие растворимыеинертные соединения, как полиэтилен гликоли или поливинилпирролидон. Порошкообразные смеси или реактивныетаблетки обладают конечным весом примерно 50-200 мг-, предпочтительно50-80 мг.20 Для приготовления лиофилизатовс общим весом примерно 5-20 мг, предпочтительно примерно 10 мг, высушивают вымораживанием раствор, которыйсодержит наряду со всеми необходи мыми для теста реактивами обычныеобразователи каркаса, например поливикилпирролидон, и при известныхусловиях другие наполнители, например маннит, сорбит или ксилит,калия, бромат калия, хромат калия.феназин"метосульфат или соли тетра--3 1Ф1 О- 10 моль/л раствора для пропитки, наносимой массы или исследуемой жидкости,Составной частью диагностическогосредства для обнаружения протеолитических ферментов, в особенности лейкоцитных протеаз, может быть смачиватель, так как при этом достигается сокращение времени реакций и лучшая окраска. Предпочтительно используются неионогенные, однако такжеамфотерные, катионо- или анионоактивные смачиватели в концентрациях0,05 - 27., предпочтительно 0,1-17.Для приготовления предлагаемогодиагностического средства, напримерпоглощающий носитель, предпочтительно фильтровальную бумагу, целлюлозуили прочее иэ синтетических волокон,пропитывают растворами обычно применяемьмх для приготовления тест-полосреактивов (субстрат, буфер, при известных условиях смачиватель, окислитель и т,д.) в легколетучих растворителях, например вода, метанол,этанол или ацетон. Это целесообраз- ЗОно осуществлять в две раздельные1стадии: сначала пропитывают воднымраствором, который содержит буфер идругие водорастворимые добавки, затем раствором субстрата протеазы общей формулы 1. В специальных случаяхможно также применять обратную последовательность пропитки.Готовую тест-бумагу можно применять как таковую или приклеивать надержатели (ап ЬггЕ 1 еп) или предпочтительно запечатывать между пластмассами и мелкоячеистыми сетками. Для приготовления покрытых пленкойфф тест-полос все реактивы вносят в раствор или дисперсию пленкообразующего вещества, например поливинилового эфира или полиамида, и гомогенно смешивают, Смесь наносят тонким 5 ф слоем на пластмассовый носитель и высушивают, Предлагаемые покрьггые пленкой тест-полосы после высушивания разрезают и их можно применять как таковые или известным,образом 53 их наклеивают на держатеди или на 1пример, запечатывают между пластмассами и мелкоячеистыми сетками,Диагностическое средство в форме раствора содержит предпочтительно все необходимые для теста реактивы. В качестве растворителей принимают во внимание воду или смесь воды с водорастворимыми органическими растворителями, например метанол этанолЭ 1 ацетон или диметилформамид, Для устойчивости (при хранении) можно рас,пределять необходимые для теста реактивы на два или более растворовЭ которые объединяют вместе лищь при непосредственном исследовании,Таким образом, полученные диагностические средства позволяют обнаруживать наличие протеолитических ферментов, в особенности лейкоцитных протеаз, Образовавшуюся окраску можно оценивать визуально или фотометрически, например ремиссионнофотометрически или в кювете. Так как активность лейкоцитных протеаз на клетку можно рассматривать по существу как постоянную величину то на интенсивности образования окраски можно определять концентрацию лейкоцитов в исследуемой жидкости организма. При этом с помощью пред