Фрагмент днк

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) АПгпапзЬег 9 ег В, ет а. Мо 1, Оеп, бепет., 1985, 198, 514 - 520.Ч 1 е 9 епйагс 1, ет а 1, Апбгп 1 сгоЬ, А 9 ептз, СЬегпотпег., 1989, ЗЗ, В 8, 1153-1159. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой фрагмент ДНК, обусловливающий синтез 3 -аминогликозидацетилтрансфера. 3 -аминогликозидацетилтрансфераза - фермент, продуцируемый клиническими штаммами микроорганизмов и обусловливающий инактивацию таких клинически важных антибиотиков, как гентамицин, тобрамицин, сизомицин и нетилмицин, в результате чего продуцирующий этот фермент штамм микроорганизма приобретает резистентность к перечисленным антибиотикам. Известны детерминанты резистентности, кодирующие гены аасС 2 и продуцирующие фермент ААС(3) - 11. Гены аасС 2 выделены из штаммов, распространенных в Чили и Нидерландах,На основании известной нуклеотидной последовательности сконструирован ДНК- зонд, представляющий собой ЯрЫ-Яа 1 фрагмент ДНК размером 0,8 т.п.н,.,Ж 1761806 А 1(54) ФРАГМЕНТ ДНК, СОДЕРЖАЩИЙ ГЕН РЕЗИСТЕНТНОСТИ К АМИНОГЛИКОЗИДАМ аасС 2 а, КОДИРУЮЩИЙ 3 -АМИНОГЛИ КОЗ ИДАЦЕТИЛТРАНСФЕ РАЗУ ТИПА 11 а(57) Использование;биотехнология,генетическая инженерия, Сущность изобретения: из Я-плазмиды трансконьюгата клинического штамма Е.со 1 выделена детерминанта резистентности к гентомицину размером 2273 п.н., содержащая неизвестный ранее ген аасС 2 а, определена нуклеотидная последовательность этой детерминанты, 2 табл,Целью изобретения является создание ДНК-зонда для выявления неизвестного ранее гена аасС 2 а,Типы аминогликозидинактивирующих ферментов можно определить по профилю резистентности штаммов к аминогликозидным антибиотикам, По профилю резистентности, детерминанта устойчивости, клонированная нами, кодирует фермент типа ААС(3) - 11 а, не описанный ранее и отличающийся по профилю резистентности от фермента типа ААС(3) - 11 более высоким уровнем резистентности к изепамицину - аминогликозиду, используемому для определения типов ферментов, инактивирующих гентамицин,Для выявления штаммов микроорганизмов, содержащих ген, кодирующий фермент ААС(3)- 11 а, необходимо выделить детерминанту резистентности содержащую распространенный в СССР ген 3-аминогликозидацетилтрансферазы типа 11 а и на основании его нуклеотидной последовательности сконструировать ДНК-зонд. Этот зонд, используемый для выявления гена аасС 2 в клинических штаммах микроорга 176180610 и рЛЧОЗ. 20 25 30 35 40 55 низмов, может применяться в химиотерапии гнойно-септических и особо опасных инфекций,Для достижения поставленной цели из Я-плазмиды трансконьюганта штамма Е,со, продуцирующего фермент ААС(3) - 11 а, клонирована детерминанта резистентности к гентамицину, представляющая собой Нпбфрагмент размером около 2,3 т.п.ни при помощи метода Сангера определена нуклеотидная последовательность этой детерминанты резистентности, Нуклеотидная последовательность Нпбфрагмента содержащего ген аасС 2 а, приведена в табл, 1.Ген, входящий в состав секвенированной детерминанты резистентности, содержит открытую рамку считывания размером 856 п,н кодирующую фермент ААС(3) - 11 и локализованную между 819 и 1676 нуклеотидами, начиная от 5 конца, Показано, что ген кодирует белок с мол.м, 30,6 килодальтон, Выявлено, что секвенированный ген содержит отличный от известных ранее промотор и ряд нуклеотидных замен в структурной части, Эти изменения позволяют отнести секвенированный нами ген к типу аасС 2 а.В табл. 2 представлены регуляторные области гена аасС 2 из плазмид рИ/Р 14 а, рИ/Р 116 а и рЧОЗ, а также секвенированного гена аасС 2 а. Регуляторные области гена аасС 2 из плазмид рИ/Р 14 а и рИ/Р 116 а идентичны регуляторной области плазмиды рЧОЗ за исключением участка протяженностью 20 п,нприсутствующего в промоторной области плазмиды рЧОЗ, Последовательность длиной 20 п,н. плазмиды рЧОЗ содержит альтернативный - 10 бокс промотора, В регуляторной области секвенированного гена в направлении к 5 концу, начиная от старт-кодона, расположен участок длиной 18 п,нсовпадающий с таковыми регуляторных областей генов аасС 2 плазмид рИ/Р 14 а, рИ/Р 116 а и рЧОЗ, В этом участке расположена последовательность ШайнаДальгарно 66 Аб, За гомологичным участком расположена последовательность длиной 9 п.нотсутствующая в генах, секвенированных ранее, Далее вновь следует область длиной 8 п,н., присчтствчюшая в плазмидах рИ/Р 14 а,рИ/Р 116 а и рЧОЗ. Вслед за участками гомологии в гене из плазмиды рЯЧ 11 (плазмида р.С 19, содержащая Нпсфрагмент с геном аасС 2 а) следует протяженная область, абсолютно отличающаяся от регуляторных областей генов аасС 2 плазмид рИ/Р 14 а, рИ/Р 116 а и р,1 ЧОЗ.При сравнении структурной части секвенированного гена с геном из плазмиды рИ/Р 113 а показано наличие 3,5замен нуклеотидов и 5,6 аминокислотных замен в молекуле фермента. При сравнении структурной части секвенированного гена со структурными частями генов аасС 2 плазмид рИ/Р 14 а, рИ/Р 116 а и рЛЧОЗ выявлено 3,15 нуклеотидных замен и 4,2 , аминокислотных замен в молекуле фермента, На основании этих данных можно сделать вывод, что секвенированный нами ген эволюционно ближе к гену из плазмид рИ/Р 14 а, рИ/Р 116 а При сравнении последовательностиструктурной части секвенированного гена с последовательностями структурных частей генов аасС 2 плазмид рИ/Р 14 а, рИ/Р 116 а, рЧОЗ и рИ/Р 113 а обнаружено в общей сложности 43 нуклеотидные замены, определяющие 20 аминокислотных замен в молекуле фермента, т.е. наблюдается 5,0 различ,.й в нуклеотидном составе и 7,3- в аминокислотном. Нуклеотидные замены, обусловливающие замены аминокислот в последовательности гена, локализованы достаточно случайным образом, На основании определения степени гомологии секвенированного гена и известных генов аасС 2, секвенированный ген отнесен к типу аасС 2 а.Для достижения цели сконструирован ДНК-зонд, основанный на неизвестной ранее заявленной нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК, содержащего ген аасС 2 а, ДНК фрагмента размеров 2273 п,н. подвергнут гидролизу эндонуклеазой рестрикции Есор Ч, образовавшиеся фрагменты разделен методом электрофореза в агарозном геле, фрагмент размером 537 п.н. элюирован из агарозы, очищаем при помощи двукратной экстракции фенолом и двукратного осаждения этанолом. Полученный таким образом фрагмент ДНК радиоактивно или нерадиоактивно метят и используют в экспериментах по ДНК-ДНК гибридизации.П р и м е р, Клетки клинического штамма Е,со 164, резистентного к гентамицину, тобрамицину, сизомицину, нетилмицину и продуцирующего фермент ААС(3) - 11 а, выращивают в-бульоне в течение ночи при 37 С, Из бактериальной суспензии изолируют ДНК В-плазмиды, имеющую мол.м, 70 Мд и содержащую детерминанту резистентности к гентамицину, тобрамицину, сизомицину и нетилмицину. Выделенную ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Нпби лигируют с ДНК векторной плазмиды рОС 19, гидролизованной эндонуклеазой Нпб , Смесью, содержащей лигированные молекулы, трансформируют реципиентный штамм Е,со, М 101, Транс 1761806форманты, содержащие рекомбинантные плазмиды, отбирают на агаризованных средах, содержащих гентамицин в концентрации 10 мкг/мл. Отобранные трансформанты рассевают до отдельных колоний на агаризованной среде 1 В, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, Отдельную колонию выращивают в жидкой питательной средеВ в течение ночи и выделяют ДНК щелочным методом. Проводят в стандартных условиях гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазной рестрикции Н 1 пб 11 и в присутствии маркеров молекулярной массы устанавливают, что детерминанта резистентности к гентамицину, сизомицину, тобрамицину и нетилмицину находится в составе Н 1 пб 111 фрагмента размером 2,3 т.п,н,При помощи метода Сэнгера определяют нуклеотидную последовательность клонированной детерминанты резистентности. В результате компьютерной обработки результатов ген отнесли к типу аасС 2 а,Из лабораторного штамма Е.со 11, содержащего рекомбинантную плазмиду рЯИ 1, щелочным методом выделяют плазмидную ДНК в препаративных количествах. Проводят рестрикцию плазмидной ДНК эндонуклеаэой Есо Ю. Фрагмент размеров 537 п,н. вырезают из геля, проводят электроэлюцию в диализный мешок, очищают двукратной экстракцией фенолом, двукратным осажде 5 10 15 20 25 30 нием этанолом. Радиоактивное мечение фрагмента проводят реакцией ник-трансляции. Радиоактивно меченый фрагмент используют в качестве зонда в экспериментах по ДНК-ДНК гибридизации.Таким образом, определена нуклеотидная последовательность гена аасС 2 а, Сконструированный на основанииэтой последовательности гибридизационный зонд, представляющий собой Есо КЧ фрагмент размером 537 п.нможет быть использован для выявления этого гена, Полученный в результате осуществления поставленной цели зонд радиоактивно или нерадиоактивно метят и используют в экспериментах по ДНКДНК гибридизации, Результаты, полученные при гибридизации со сконструированным из ДНК гена аасС 2 а зондом, могут применяться для рационального выбора антибиотика в химиотерапии гнойно-септических и особо опасных инфекций,Формула изобретения Фрагмент ДНК, содержащий ген резистентности к аминогликозидам аасС 2 а, кодирующий 3 -аминогликозидацетилтрансферазу типа 11 а, полученный в результате элюции из геля продукта гидролиза рестриктазой Н 1 пб 111 рекомбинантной плазмиды рЯЧ 11, реплицируемой в лабораторном штамме ЕзсЬег 1 сЬ 1 а со К 12, размером 2273 п.н, со следующей нуклеотидной последовательностью.17 б 180 бТаблицамиО 20 до 50 ЬО 70 80 ео Оо оТТТВЬТРСТС ТСАЬААТАСС СТТТТБРВТТ СБТТТТТБТБ ССРДСАВРАС йцСССБТАВБ ТЙЙРТСТСББ АВСАТТТСЯБ гцййбТБТСТБ ТВТВЯБТТБЙ ЙТСТВййТИ 11 САБТТААТйТ ТТТРБТСБТС ААСЬТСТтйб БСВРСТТСАА ТБСЙВББСЬД ССТСБТТТТТ тббСНВБСББ ТТтТйСРРСР ббйбббйбйА СТйТТТТСТС ЙРСАССТТСЬ221 СОТБСТБбйй ТСАТБВТТБС ДТСйСВВРСТ ййтДТ 6 ДСИ йТТйАСБТРТ ССБСйДБАТГ ВбйСТТСАСС ЯТСТБСТСАТ БййСВСБАБТ ОВТТЙБТТТй СВСВСТБСЯР551 ДТТСРБСЙРР ййСАСББСТй ААТБТСССТТ СцСТИБТйб ТТТТТТйТАС ЙБЯТТВЙЯБС СБСАййТТСВ ССБСййТСТй С 6 ЙТСЙЙСТТ СТАББС 6 ТТС ййТСААБССС441 СБТВТВБТВЙ СБЯТРССййБ ТТСАБСТТТТ БСДйТййййб БбйбйБССЙ РРИБСйКВ БТСРВСРБВА БСТСТТСССй СйОСйСАССС ТТВАТРТТББ ТАТАССАРИ551 ЯТТСБЯТВТС ЯСТССЯСТСЕ ЯВСЯСЯСВЯЯ 1 РР 16 СБТТС БДБСТТТЕЯБ СТВДТБССБТССТРАРТСОБ СТБСВйСТЯР йбВААТЙАВТ ТСБТАТТБТА йББСТТВААР-35 ТТБЙСР -10 ТАТААТТйбйРБСТСА ТТТТААСйТС ТАСйАСТТТТ ТТСЯДДЯААТ ВТТАРТТСДББЫ ССВТТОТТТБ РВРАААБББСТТйРТВТАБТ ЯТТСАТбСТВ ТАСйТБТТЙВ ББТБТТИТТййАВТВССТССА ТТТДБАйбйб ДТЙТгбСВДТ ВСАТЙСБСцбААСВСААТйЯ СБВРБВСВСТ ТСААЙААСТС БЬЯБТССААР ССВСТБЙССТ771 ВСТВТТТВТС ЬйВТТТТВСйСцТТБССВСВ ТТРСБСТССВ СББТТ 686 СС 6 ЙСТВБСДСТ БТБЙ 1 БББРТ881 ДТТБДТИТВ СЯТБССТСЯС ТТДДДВИДТ 1581:СББС БРДИДИДБ СгцбйгцЯСбгбТ49 АСЕСйТСБТб СбйССВРТСР ССС",ЙСБЙББ ЙЕДСТСЕТЙР ТбцСцСТСЬБ ТТСОйТбйСй ййАССССССц ТйССТ 65 ССБ ССБТТСВйТС ССВСААСБСС СЕЬБРСТТАС106 СБТБВВТТГБ БССТБСТВйй ТСРБТ 1 ТСТЬ гТТСййбгСС ССББгбгбгб БгцбйБСИВ СДСгССБАТБ САТСБДТББТ СБСБВТТББТ ССйСТБВСТБ йййСБСТБРГ1211 ББНБССТСЯС АРБСТСВВТС ЯСЬССТТЕгцб ИЙАВЕбтСБ ССГЬТСЕйбС гцбТТСВТТСЬ ССТТББСББВ РРБОСССТБС 181168618 С Э:СВСТНДЙС 1 ССБТТДССБ 521 СйТТССйСТА СБгСБАБОСЬ БТТЕгСБйТА ТССССЯАСРЯ ДСВБСВЕБТЬ РСБТЙТЬйбй ТБССБАТБСТ ТВБЯЙСгРРС гцВССААБТСВ ССТББААРДС ЬССРТСИйТ 1451 ТйСбйТТСРР йСББСАТТСТ СБйТТЕСТТТ ЕСТАТССййб БЯРРВССБОЙ ТЬСЕБТСБйй ЙСТЯТЯЬСДЯ ЯТВСТТЙСВТ БййВСТСББТ СБССйТССйц РРВВТБТСВТ1541 БВССТТТБСТ САБТБГТАСС ТВТТСбйСц Б йцбйСАТС ОТбйСВТТСВ БСБТСАССТР ТСТТбйцйНБ СйТТТСББРА ССАСТССВАТ СВТБССАц Р СРСВЯЯБТСгца 51 ССБРВТЬСТС ТТБСцйСС.Т ТСйСБТТйбй БВССЬСЬЙС ДРТЬЙТйАТС ТБСАТСйЯСц ЕАССТТТСБС СБСБСВйййб АСБЙСБСТСЬ СТБЙВС 86 ТТ ВСБСВйТСЕБ7 Ы СБТТССРЙАТ СВСтбйТСТТ ТбйССССЕРБ ЕДЙДТСБББТ тСБТТБТЬйй РбййдССВТС СССйТВСС 66 СбйБСцбйбй СТЙТСАБЬЙТ СТССТйТТАТ БСЯРТТАЯТС187 СЯРРНАСТБС ССАБДДАБТТ ЙЙТЙЙТСТД 5 ЙДТТСТТТСС СТТВЯЬТЙТТ СддйбгцЙЙСТ ТСТЙЙТЙЙЯТ РТТЙТТСЙАБ ЙЙДРТАЙЙСЙ АТСТЯТТСДЙ ДЙАДТТбдйб 1481 ДйДтйТТЙСА ТАГСй 1 йдТД ССТЕТТСАВТ ТйТСТ 6 ДДВй тТСТЬЯДРЯТ ЕДРТйтцДДС бйгц 1 гбСТБТС РййРТСДДТА ДАТВСйЬСАТ ТТЙЙДДЙСТО СБЕРВССАЯЙ2041 БДДБЬдгцййй ТТАТТСДЯбгц ЕСййгДС ТД ДДТДЙБТТДЕ тДБДДТБТСТ ДСТДВДАБЯД ТТДНСТССТТ ББДТДДДТСД ТДДСЯТСДДБ ДДДТДБДССР ттДДТТБЙД201 СДйТТТСТТА ЙДБТТСТЙБТ ДГТСАСДТГТ йбг 15 СТТТБ АДРТТтСДДТ ДтТЙССРТА СССТБСТТТТ ТДН(о 5 Ч 1 1 Ие 1 Н 1 ь ТугАга (.ус й 1 а Пе ТИг Ец йа(.ец 15 и уг Сец 51 Ча 1(оИР 15 А Иет Н 1 ь ТИгНп Су А 1 а Пе ТИг 51 ц Аа(.ец 15 п(.ч: .ец Еу Ча 1 51 п ТЬг 16 у(йьр Сгц ец Ие. Ча 1 Н 1 е А 1 а Бег Сец .уьАа Пе 51 у Рго Ча Бц 7 51 п Тиг 16 у 1 Ар ецец Ие Ча 1 Н 1 ь йа 5 егецуь 1 йа П е 51 у Ргс Ча 61 ц 61 п ТЬгБегАьр Сец 1.ео Иет Ча Н 1 а А 1 а 5 ег Сец СуьБегПе Еу Рга Ча 1 Ец 81 у Еу й 1 а 51 о ТЬг Ча 1 Ча й 1 а й 1 а (.гц йга Бег й 1 а Ча 1 81 у Рго ТИг С 1 у Тиг.6 Еу 81 у йа Но ТИг Ча 1 Ча 1 А 1 а й 1 а Сец йгс Бег йа Ча 1 81 у Рго ТЬг Ну Тпг Ну 81 у й 1 а 81 ц ТЬг Ча 1 Ча й 1 а й 1 а Сец йгс Бгг й 1 а Ча 1 81 у Его ТЬг Ну Тиг Ча 1 Ие 81 у Туг й 1 а Бег Тгр йьэ йгп Бег Рго Туг 61 ц Б 1 ц ТЬг Еео,йси 51 у йаЫ Ие 6 ч Туг йа Бег тгп Ао Агп Бег Его Туг Сц Нц ТпгАга(йг, Нч йа Ча 1 Игт. Б 1 у Туг й 1 а Бег тгр йо йга Бег Рго Тчг Ец Б 1 ц Тпг(.ец 1 йсп 6 у й 1 а йгп .ец Аьр йьр Гувд ГА 1 а 1 йгп йга ТИг тго Ргп Рго РИе Аьр Рго А 1 а Тпг А а 61 ч 74 йго Сец йьр Акр 1(.у1 ТЬг Аго йгс Тпг Тгр Ргэ Рго Риг Аьр Рго й а Тпг Й 1 а Еу йга (.ец йр йр 1 йвпА 1 аАга йга ТЬг Тга Его Рго РЬе Аеэ Рго А 1 з Тпг й 1 а Н у 3;3 ТЬг Туг йгп Нч РЬе Б 1 у .ео .ец йи 51 п РЬе .ец Ы 61 и й 1 а Рго С 1 у А 1 а йгэ 93 ТЬг Туг йга 61 у РЬе 81 у ( ец Сец Асп Е и Рпе Сец Ча 1 81 п Аа Ргп Е у А 1 а йга Тиг Туг Агп 81 у РЬе Еу ец .ец йпп Б п РИе Сец Ча 1 51 п А 1 а ого 51 у й а йгаПе Ча 1 тпг РИг Еу Ча,г тч Сец СцПе Ча Тпг Епе Гч Чд Тьп угец Г 1 и Пе Ы ТЬг Рпе 61 у Ча Т Тяец Ец Суь Туг ец РЬе Аьр А 1 а Еп Аса Суь Туг ( ец РЬе йьо А 1 а Еп йо Суп Туг .ец РИе йьр й 1 а 81 п Аео Н 1 п РЬе 6 у(йа 1 Тиг Рго Пе Ча 1 Н 1 РЬе 8 у 1 ТЬг 1 ТЬг Рга Пе Ча 1 Н 1 ь РЬе 8 уТуг Туг Рго Пе Ча 13Рго Бег НуРго Бд 51 уЕго йег Еу 61 п 245 81 п НпРса Аа Нс йц 1 йа(14 а15 пйгп сеп Рго йа Н 1 с 51 ц Ы 1 йа 15 ц СуББег Су Рга й 1 а Нс 6 ц Аа 1 Пе 5 ц (Ага(Бгг Спче3( 1Агп Бег А 1 а Н 1 ь Рго Аьр А 1 а Бег Иет Ча 1 йа Ча 1 Еу Ргсец йа Е ц ТИг ( ец 12 йгс Бег А 1 а Н Рго йр й 1 а Бег Ие". Ча А 1 а Ы 5 у Ргоец й 1 а Е л Тпг Сец Ага Бег А 1 а Н 1 ь Ргп Асп А 1 а Бег Ие 1 Ча А 1 а Чз 5 ч Ргоец йа 51 ц Тпгео ТЬг Ец Рга Н 1 ь(8 цец Еу Н,с А 1 а Сец 81 у Ец 6 у Бег РгоЛа 5 ц йгп Рие3 ТИг Б 1 ц Рго Нл 1.уь 1.ец 8 у Н 1 я А 1 а .ец Еу 51 ц 5 у Бг Рго,Ча 1,Бц йгп РЬе ТЬг Ец Ргс Н 1 55 ц 1.ец 6 у Н 1 п А 1 а Сец Еч 51 ц Ну Бег Рго 1 йсп 16 ц йгс еМ Ча Агс Сец Еу 61 у .ус А 1 а Сец ец Сец Н у й 1 а Егс Сец йьи Бег Ча 1 Тиг й 1 а 50 Ча 1 Ага .ец 61 у Еу .уь й 1 а Сец Сец (.ец 61 у йа Ето ец йаи Бег Ча 1 Тйг А 1 а Ча 1 йга ( ец Еу Ну (.уь Аа .ец Сецец 81 у й 1 а Рго (.ец йсп Бег Ча 1 ТИг А 1 а.ец Н Туг йа Ец й 1 а Ы й 1 а Аао Пе Рго йп уь Агп(тгэЧа т( г Туг 61 ц 69 Сец Н 1 ь Туг А 1 а 81 ц А 1 а Ча 1 А 1 а йгр Пе Рго йспч йгп йгс,Ча 1 Т 1 г Туг Б 1 ц.ец Н 1 ь Туг А 1 а 61 ц й 1 а Ча 1 й 1 а йер Пе Рго Агап (.у Ага Тго(Ча Тпг Туг 61 ц Ие Его Ие(ец 16 убей 1 йси 151 у 61 ц Ы А 1 а Тгэ .у Т"г А 1 а Бег,51 Туг й=э 188 Ие Рго Иг.ец 16 уБег 1 Аи:8 у Нц Ча 1 Аа Тгэче Тпг й 1 а БегАеэТчг йср Иеэ Рго Ие(.1 Рго 18 у 1 йга 1 Аьр 18 у 8 ц Ча 1 й 1 а Тгэус ТЬг йа Бг.,йеэ,Тчг йеэ Бег йи 5 у Пе .ец йео Сче ЕИе й 1 а Пе 81 ц Б 1 у (.че,ргойэ йа ча Етг 207 Бог йп 6 у Пе (.ец Асс Сус йИ- й( а те 61 ц Еп у 1 ч 1 РгаАп А 1 а ";1 й, тп Бег Асп Еу Пе ец йсэ СуЕИе йа Пг 6 ц Еу Су 16 ий-р й- :Ча Пе й 1 а йи А 1 а Туг Ча уе Сец 81 ч й и Н. йгс 51 ц Б 1 у Ча. Ч=1 Е, ие и. а 226 Пе й 1 а йп А 1 а Туг Ча 1 1 л ец Ну йга ".1 а йгп 51 ц 51 у Ча 1 а :.ч Рпе й 1 а 11 е А 1 а йп А 1 а Туг Ча 1 Ь ец 81 у йсп Н 1 е йгэ 51 ц Еч Ча 1 Ча 51 у Епе й а