Способ индикации токсигенных коринебактерий дифтерии

.су, 1983,(5 (5 СИГБН КО я к меди 1 ано в экне медицине, экспрессупрощение спочувствительт цепос 1т оцелл ствецц и ра корин с одн изб их клетороны, зационм е по о К е вор змиды ь гают ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИПРИ ГКНТ СССР 440 б 330/30-1321.03.8830.12,90ИнституткогоА.А.Бобков, М.Р.11 обГараев, С.И.Комбяровва и С,С.Маркина52,5: 575.224.2:577,пГесГ.оп апй 1 гцчцп48-5 б.СПОСОБ ИНЛИКАЛИИ тОНБАКТБРИ 11 ЛИАТ ГРИИИзобретение относитможет быть использо Изобретение относится ки может быть использовано вдиагностике диАтерии.Цель изобретения- соба без снижения егоности.В данном техническом решеработан такой способ лизисабактерий диАтерии, который,стороны, позволяет разрушатьточную стенку, а, с другой сне мешает проведению гибридиного анализа, заключающийсячто клетки лизируют с помощьдовательной обработки лизоцидодецилсульАатом натрия (ЛСНмобилизуют и денятурируют ЛНзаты на нитроцеллюлозном Аилпутем обработки щелочью, Затводят обработку Аильтра растсодержащим ЛНК гибридной пласодержащей последовательностгена, после чего Аильтр подв спресс-диагностике диФтерии. Цельюизобретения является упрощение способа при сохранении его чувствительности. Лоставленная цель достигаетсяза счет того, что разработана последовательность обработки анализируемыхклеток либо в суспензии, либо нанесенных ня нитроцеллюлозный Аильтрраствором лизоцимя, я затедм раствором додецилсульАятя натрия. Это позволяет значительно упростить способиндикации токсигецных корицебактерийдиАтерии путем гибридизяциоццогоанализа ЛЛК анализируемого материалас Л 11 К-зондом. радиоявтограАировяццю; положительными считают пробы, дающие засветку ня радиоявтограАе, Другой вариант заключается в том,что выращивание клеток, содержащих коринебяктерци диАтерии, проводя една поверхности ци р юлозцого Аильтря, помещенного ца цоверхцость питательного агяря. Л ровацие кле ток в этом случае проводят н следую щих условиях.Л р и м е р 1. Клетки корицебак терий диАтерии выращивают в 50 мл с ды СЛ следующего состава, г/л, кязаминовые кислоты 25, дрожжевоц экстракт 15, 1.-триптоАян 0,2, глутами новая кислота 0,2, цистиц 0,4, пантотенат кальция 0,01, Вга 1 п НедгС 1 пГцз 3.оп 37, рН 7,2.Непосредственно перед употреблением к 1 л указанной среды добавляют 2 мл среды следующего сос 1 явя, г/л: М 880 225; ф-аланин 1,15; цц 161699110 30 50 котиновая кислота 1,15, биотин 0,075;СцБО 4 5 НО 0,5; ЕйБ 0,1 7 НО 0,8;МпС 1 4 Н О 0,3 р НС 1 ци, 60 мп. Клетйки вйращивают до титра 107 кл/млв течение 24 ч, затем осаждают центрифугированием (4000 я, 10 мин,+4 С) и ресуспендируют в 50 мл09 01 М трис- НС 1, рН 8,0, Клетки повторно осаждают и ресуспендируют в8 мл буАера, содержащего 0,5 М сахарозы, 0,01 М трис-НС 1, рН 8,0. Ксуспензии клеток добавляют лизоцимдо конечной концентрации 2 мг/мл иинкубируют в течение 2 ч при 37 С.Клетки осаждают центрифугированием,ресуспендируют в 8 мл буАера, содержащего 0,01 М трис- НС 1, рН 8,0,0 01 М ЭДТА, добавляют ЛСН до 1 Х и9йинкубируют ггри 65 С в течение 15 мин, 20Для гибридизации полученные описан: -ным образом лизаты наносят по 3 мклна нитроцеллюлозный фильтр, Денатурацию и Аиксирование ДН 1( на Аильтрепроводят, последовательно помещая его 25на подложки из Аильтровальной бума. -ги, смоченные растворами следующегосостава: 1) 0,5 к ЙаОН в течение10 мин; 2) трис- НС 1 1 М, рН 7,.5 - втечение 12 мин:(повторяют дважды);3) 0,5 М трис- ЦС 1, рН 7,5; 1,5 МИаС 1 - в течение 10 мин; 4) 2 хх ЯЯС (ББС - 0,15 И 1 ЯаС 1, 0,015 Мцитрат Иа) - в гечение.5 мин. ЗатемАильтр подсушивают на воздухе и помешают в вакуумный шкаА на 2 ч при800 Г,Прегибридизацию проводят в течение 4 ч при 65 Г в растворе следующего состава: 5 кратный раствор Денхардта (раствор Денхардта, г/л: Аиколл 10, поливинилпирролицон 10,бычий сывороточный альбумин 10),5 х БЯС, 0,2, ДСИ, ЛНК спермы лосося 100 мкг-мл, 32 р - меченую ДНКплазмиды рПТ 41, используемую в ка -честве зонда, денатурируют путемкипячения в течение 5 мин с последующим охлаждением во льду, Гибридизацию проводят в течение 3 ч при65 Г, помещая Аильтр лицевой стороной на поверхность гибридизационной смеси - буАера для прегибридизации с денатурированным препаратомДНК-зонда ( 0,02 м 1(и/мкг ЛН 1 - инаслаивая вазелиновое масло для герметизации. Отмывку фильтра проводят,последовательно помещая его в растворы следующего состава: 1) бувают ту же чувствительность, что и в примере 1.Таким образом, разрабо анный способ позволяет упростить проведение определения токсигенных коринебактерий диАтерии без снижения его чувствительности.Формула изобретения Способ индикации токсигенных коринебактерий дифтерии, предусматривающий разрушение.клеток лизоцимом и детергентом, нанесение образцаСоставитель Т.ЗабойкинаТехрец Л.Олийнык Корректор Н.Ревская Редактор М.Недолуженко Заказ 4097 Тираж 495 Подписное ВНИИЛИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина,101 5 161699на фильтр и гибрщизацию его с ДНКзондом, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью упрощения способапри сохранении точности, в качестведетергента используют додецилсульат 1 бнатрия, а на фильтр наносят клеточный лизат, при этом клетки разрушают при температуре 65"С до или притемпературе 100 С после нанесения нафильтр.