Способ выявления микобактерий

(5)5 С Комитет по пате НИЯ АТЕНТ титут им. овА др. Бюл,ИИ РА Й ТУБЕ обиоло мия, в ия, моле- частности опыты н трудоем Крокации нуклеот плавле послед собой, ментов нантны вектора извх Д ссматриваем в каанныи метод мые прототипа.едостатками расвляются большать, связанная с фрованием специ отсутствием уных ДНК-зондов,ств Нсматриваемого спосложность и трудорагментированием и фических участков иверсальности полт.е. необходимости собаемкосклониДНКучаем оссийской Федераци ам и товарным знака ПИСАНИЕ ИЗОБ(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИА ЛИЧНЫХ ВИДОВ МИКОБАКТЕРИ КУЛЕЗА(57) Использование: микр кулярная биология и биохи Изобретение относится к микробиологии, молекулярной биологии, биохимии, в частности к способу дифференциации и идентификации различных видов микобактерий туберкулеза, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях,Известен способ дифференциации микобактерий, основанный на методах биологических, бактериологических и биохимических исследований, Эти комплексные исследования включают скорость роста; образование пигмента (на свету или в темноте); способность к росту на простых питательных средах и при температуре 20- 25 С; каталазная активность; пероксидаэная активность; термостабильность каталазы; первичная устойчивость к препаратам первого ряда - стрептомицину, изониаэиду, ПАСК. Важную информацию дают Ю 2, 2000331 С способ дифференциа микобактерий, в част беркулеза, Сущност бактериофага М 13 со ве уникальные, повто тельности нукл последовательности микобактерий туберк ваются рестрикцией беркулеэа, элект гибридизацией ДНК-э жение полос (участков вательностей нукл специфичным для каж рий туберкулеза и по ровать их, 1 ил. ции различных видов ности возбудителя туь изобретения: ДНК держит в своем состаряющиеся последоваеотидов, Такие имеют место и в ДНК улеэа. Они обнаружи- ДНК микобактерий турофорезом их и ондом М 13. Располоуникальных последоеотидов) является дого вида микобактезволяет дифференциа животных. Данный метод является ким и продолжительным (до 3 мес.). ме того. известен метод идентифимикобактерий путем определения идного состава ДНК по температуре ия, степени подобия нуклеотидных овательностей в сравнении между где требуется клонирование фрагестного ДНК, создание рекомбиНК-зондов на плазмидныхразработки ДНК-зондов, специфичных для каждого аида микобактерий.Целью изобретения является упрощение и повышение надежности и специфичности способа дифференциации 5 возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота Ы,Воч 1 э от атипичных форм микобактерий на основе универсального ДНК-зонда, а также межвидовая дифференциация микобактерий туберкулеза, 10Это достигается применением метода определения гипервариабильных последовательностей в геноме микобактерий с помощью ДНК-зонда, приготовленного из ДНК бактериофага М 13. 15Сущность изобретения состоит в том, что, используя зонд из ДНК бактериофага М 13, устанавливают гипервариабильные участки ДНК генома микобактерий, которые имеют различную локализацию во фрагмен тах ДНК в зависимости от их видимой принадлежности.Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что применение фермента рестрикции Есо 91 1 и зонда из ДНК бактериофага М 13 позволяет определить гипервариабильные участки ДНК различных видов микобактерий, что дает возможность установить из видовую принадлежность, 30Таким образом, заявленное техническое решение соответствует критерию новизна.По сравнению с прототипом, где требуется клонирование фрагментов известного 35 ДНК, создание рекомбинантных ДНК-зондов на плазлидных векторах, созданный универсальный зонд из ДНК бактериофага М 13, благодаря рестриктаэе Есо 91 1, дающей широкий спектор гибридизирующих 40 полос, дает воэможность определения и распознавания микобактерий от патогенного штамма и друг от друга, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию существенные отличия. 45Из бактериальной массы каждого вида микобактерий выделяют ДНК, обрабатывают их рестриктаэой Есо 91 1 и подвергают электрофорезу в горизонтальном блоке 0,8/,-ного агароэного геля с последующим 50 блоттингом по Сазерну и ДНК-ДНК гибридизацией с ДНК-зондом М 13.1. Выделение хромосомальной ДНК из патогенного штамма М.Воч 13, атипичных микобактерий М,Мапэаэ 11, М 1 мгасе 1 о 1 аге и 55 сапрофитного М.рЫе.Бактериальную массу в количестве 1 мг 2 раза отмывали в 10 мл ЯЯРЕ (ЗМ йаС 1, 0,2 М МаН 2 РОл, 0,02 М ЭДТА, рН 7,8), центрифугируя при 5 тыс. об/мин по 15 мин. Осадок ресуспендировали в 5 мл разбавленного в холодном ЗТЕбуфере (0,1 М МаС 1, 0,01 М трис-НС 1, 0,01 М ЭДТА, рН 7,8) лизоцима (14 мг/мл). Тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 37 С в течение 30 - 40 мин. После этого добавляли 500 мкл водного раствора пронаэы (1 мг/мл) и 500 мкл 10",(, додецилсульфатэ натрия (ЮЗ), перемешивали и инкубировали при температуре 50 С во встряхивающем аппарате в течение 30 мин. Лизис клеток микобактерий сопровождался увеличением вязкости раствора. По окончании лиэиса клеток в смесь добавляли 5 М МаС 1 до конечной концентрации 1 М.Очистку от белка осуществляли добавлением равного обьема хлороформа: иэоамилового спирта (24:1). Осторожно и плавно перемешивали в течение 10 мин и центрифугировали при 6 тыс. об/мин в течение 20 мин, Супернатант осторожно отсасывали в другую пробирку и последнюю процедуру повторяли до исчезновения белого налета на границе между хлороформом и основным субстратом, После удаления белков ДНК осаждали добавлением двух обьемов холодного 96 О этанола. ДНК соби- рэли стеклянной палочкой и растворяли в 0,1 хЯЯС и обраба 1 ывали РНК-эой из расчета 50 мкл на 1 мл в течение 1 ч при температуре 37 С. Добавляли 10%-ный додецилсульфат натрия до конечной концентрации 0,5 М, проназу в концентрации 500 мкг на 1 мл,и инкубировали в термостате при температуре 37 С в течение 1 ч. После очистки ферментами ДНК экстрагировали равным обьемом хлороформ; иэоамиловый спирт (24: 1) при 6 тыс. об/мин в течение 20 мин, Иэ супернатанта ДНК осаждали холодным 96 этанолом в соотношении 1: 2. ДНК наматывали на стеклянную палочку, высушивали на воздухе при комнатной температуре и растворяли в кипяченной бидистиллированной воде. На спектрофотометре "Регк 1 пЕп 1 ег" определяли концентрацию выделенных ДНК,2. Фрагментация видов микобактерий рестриктазой Есо 91,1, дающей широкий спектр гибридиэирующих полос, электрофорез и блоттинг.Очищенный от белков ДНК микобактерий в количестве 5 мкг переносили в пробирки эпиндофора. Туда же добавляли до 18 мкл бидистиллированной воды, 2 мкл 10 х буфера рестрикции (50 мМ йаС 1, 10 мМ трисНС 1, рН 7,5, 10 мМ МоС 2, 5 мМ 2-меркаптоэтанол) и осторожно перемешивали. Затем вносили 3 мкл рестриктаэы Есо 91 1, перемешивали и помещали на 3 ч в термостат при температуре 37 С. Реакцию останавли 2000331вали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.Полученные Фрагменты ДНК подвергали электрофорезу в горизонтальном блоке0,8-ного агарозного геля при напряжении 50,8 В/см в течение 16 ч.Фрагменты ДНК окрашивали в растворе этидиум бромида в течение 30 мин ифотографировали.Следующим этапом работы является 10блоттинг, т.е. перенос фрагментов ДНК иэагарозного геля на нитроцеллюлозную мембрану. Для денатурэции ДНК гель выдерживали в 0.5 М МаОН с 1,5 М 1 чаС 1 в течение 1ч при постоянном покачивании. Затем промывэли цескг)лько рэз листдлл." еэццойводой и вцоеь выдерживали в 0,5 М трисНС 1, рН 0,0 с 1,5 М ИаС 1 е течение 1 ч споследующей отгльекой дистиллирсеэццойводой, 20Для проеедецил блоттицгэ нэ столикэлектрофоретического аппэратэ цэклэдывали 4 слоя фильт 1)опальной бумаги так, чтобы она сеисэлэ и камеру длл буфсра.Фильтровальную бумагу смачивали 10 хЯ.С 25и удаляли пузырьки воздухэ при помощистеклянной палочки, Нэ фильтроеэльцуюбумагу эккурэтцо цэклэдыеэли пластинуагэрозы тэк, чтобы це было пузырькое воздуха. Работу проводили в резиновых перчатках. Нитроцеллюлазцую мсмбрэну1 диаметр пор 0,45 мкм) предварительно выдерживали е дистиллированной воде притемперэтуре 90 С е течение 5 миц, Зэгеммембрану накладывали ца эгарозу соотеетствующей ей рэзмсрол, По крэлм эгарозыпомещали полоски полиэтиленовой пленки.Мембранный фильтр покрывали 4-0 слоямифильтровальцой бумэги, вырезанной поразмеру пластины, Сверху наклэдыеэли 2 40сухих вэфельцых полотенца, сложенных поразмеру, а цэ цих устэцэелиеэли груз с массой 1 кг, В емкость для буфера цэлиеэли10 хЯЯС и еыдержиеэли 16 ч при комнатнойтемпературе, Послс блоттицгэ цитроцеллюлозную мембрану снимали, еыдержиеэли 5мин е бх 5 ЯС и еысушиеэли ца еоздуха прикомнатной температуре 30 миц. Затем "запекали" метлбрэцу под вакуум при температуре 00 С е течение 2 ч. 50Дальнейшим этапом рэботы леллетслпроведецие гибридизации, где в качествезонда используется меченый ДНК бэктериофагэ М 13,3. Приготовление меченого ДНК М 13, К 550,5 мкг ДНК М 13 добэеллли секвецсоеыйпраймер е количестее 2 мкл и еще 1 мклбуфера для ник-трэнсллции (10 х), 10 х буферсодержит 0,1 М трис-НС 1, рН 7,5, 0,1 ММ 9 С 12, 1 М ИэС 1, 0,005 М 2-меркэптазтанол,0,1;6 тритон х. Вышеуказанную смесьставили в термостат при температуре 65 Сна 10 мин, а затем выдерживали при комнатной температуре 30 мин. За это время происходит "отжиг" праймера с ДНК М 13.В пробирку с высушенной меткой (50мкКиРдТТФ) добавляли 8 мкл смеси немеченных трифосфатов (до 200 мкмоль), 1мкл 10 х буфера для ник-трансляции. 2 мклфрагмента Кленова и весь ДНК М 13, Смесьвыдерживали в течение 1 ч при комнатнойтемпературе,Зонд очищали от невключившихся трифосфатов колоночной хроматографией йасефадексе 6-50. Удельная активность зондаопре,;елллэсь нэ сцицтилляционном счетчике, которая была равна в нашем опыте2 10 имп./глиц мкг ДНК,4, Предгибридизация и гибридизация.Нтроцеллюлозную мембрану с фрагментами ДНК запаивали в полиэтиленовый пакети ьлприцем вводили 17,2 мл предгибридизац 101 ц 10 Й сглеси,Состэе предгибридизационной смеси,мл:29 х ЯЯС 1020; ЯО 5 0,250 х ОспсЬэгд 2Дистиллироеаццэя вода 5После внесения смеси раствора из пакета удэлллп пузырьки воздуха, плотно закрепляли скрепками и зыдерживали веодлцсй бэне при температуре 65 С в течецие 2 ч,После этого прецгибридизационнуюсмесь слиеэли и вносили в пакет гибридизациоцную смесь в количестве 10 мл с меченным зондом и оставляли на 16 ч притемп рагуре 65 С.Длл отмывки фильтров после гибридизации использовали смесь следующего сосгэеэ, мл:20 х 55 С 5020 у .зОЯ 5Дисыллироеэцная вода 945После гибридизации пакет вскрывали,еылиеэли смесь в емкость для радиоактивц х отходов и отмывали. Фильтр помещалие еэццочку, заливали 200 мл отмывочногорэсгеорэ и выдерживали 1 ч при температура 65 С. Повторяли эту процедуру 2 раза.Чистоту отмывки проверяли на прибореУИМ 2-2. Затем мембрану высушивали ипомещали ь рецтгенкассету с рентгенпленкой и осэеллли в холодильнике при темперэту 1 е -70 С ца 1 б ч. По истечении времениэкспозиции пленку проявляли и делали,отосцлмки (чертеж 1),Нэ чертеже изображен радиоавтограФический снимок расположения гипервари;г ,л,. Ф: ф 3- Ъ.п. е - 19 л.и. н,7 аа Составитель И.КуэенковТехред М,Моргентал Корректор М,Максимишин едактор Л.Павлова Тираж Подписн НПО "Поиск," Роспатента13035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 э 3 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. ужгород, ул.Гагарина, 101 абильных последовательностей нуклеотидов после блот-гибридизации фрагментов ДНК различных видов микобактерий туберкулеза, расщепленных рестриктазой Есо 91 1. В радиоавтографическом снимке четко видны специфические для каждого вида микобактерий расположения полос.Сравнительный анализ гипервариабильных участков различных видов туберкулеза показывает, что М.Воч 1 з отличается от остальных видов наличием дополнительных мажорных фрагментов в области 21, 19, 16 тысяч пар нуклеотидов (ТПН) и минорных фрагментов в области 20, 14, 11 тпн; М.Мапваз 11 дополнительно имеет мажорных фрагментов в области 17,7,5,3 ТПН, а также отличается наличием минорных фрагментов в области 13 ТПН; М.рЫе 1 отличается от остальных наличием минорных фрагментов в области 15, 10. 6 ТПН; М.1 п 1 гасеМаге отличается наличием минорных фрагментов в области 16 ТПН,Технико-экономическая эффективность предложенного метода дифференциации заключается в том, что установление видовой принадлежности микобактерий туберкулеза важно при проведении противоэпиэоотических и противоэпидемиологических мероприятий, а также для диагностики ту беркулеэа. Замена громоздких и трудоемких методов исследований по дифференциации видов микобактерий надежным и воспроизводимым способом способствует сокращению времени 10 исследований, снижению затрат труда ирасхода большого количества реактивов, повышает надежность и специфичность определения видов микобактерий.Ф ор мул а и зоб ретен и я 15 Способ выявления микобактерий, предусматривающий выделение ДНК из исследуемых микробактерий, проведение гибридизации с ДНК-зондом, о т л и ч а ю щи й с я тем, что перед гибридизацией ДНК 20 микобактерий расщепляют рестриктазойЕсо 91.1, полученные фрагменты расщепляют гель-электрофорезом, перейосят на нитроцеллюлоэные фильтры, в качестве ДНК зонда используют ДНК фагла М 13, а выяв ление микобактерий осуществляют по расположению гипервариабел ьных участков.