Фрагмент нуклеиновых кислот зонд для выделения и идентификации флавивирусов

)5 С 12 О 1 йИИцщ ве т ЬИЬЛИ ПИСАНИЕ ИЭОБРЕТ ИЯ В ния и идентификации флавивирусов,переносимых комарами из подгрупп японоского энцефалита, лихорадки денге ижелтой лихорадки, Для этого синтезировали химически с использованием вкачестве мономеров защищенных дезоксинуклеозидов олигонуклеотид, состоя"щий из 20 оснований, следующей последовательности ти:5-ЙСССТСТССТСТААССТСТАС.Эта последовательность идентична длявсех расшифрованных флавивирусов, переносимых комарами, Использованиесинтезированного зонда позволяетбыстро и просто тестировать иссле.дуемый материал на наличие флавивирусов, 2 табл,н и.ЫИИМИтех отору леЗонд йредставляет собой дезоксиолигонуклеотид длиной 20 звеньев, который синтезируют химическим методом с использованием в качестве исходных компонентов модифицированных (защищенных) дезоксиолигонуклеотидов. Фрагмент НК имеет следующую нуклеотидную последовательность:5-ЙСССТСТССТСТААССТСТАС,осится к бк Фрагменти можетмиологиии иденгифиносимых кояпонс когонге и желт Изооретение от нологии, а именно иновьх кислот (НК "пользовано в эпид гии для выявления флавивирусов, пер (ФПК) из подгрупп лита, лихорадки д кле-. исФи ви русо кации марами энцефа ой лих Фра ия и идентиф кации Ф анализа довател лонных не 130 нома об 20 нукл расшиф н на основе отидных пос для ряда эт и этом в ра гконца г ательность ия для всеха японского ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗО 6 РЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСНОЬЮСВИДЕТЕЛ(71) Новосибирский институт биоорческой химии СО АН СССР(54) ФРАгмент нуклеиновой кислоЗОНД ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАФЛАВИВИРУСОВ, ПЕРЕНОСИМЫХ КОМАР(57) Изобретение относится к бинологии, конкретно к конструироФрагментов нуклеиновых кислотрые могут быть использованы в всологии и эпидемиологии, для вы радки.Создан простой и безопасный в по лучениивоспроизводимый по результатам тестирования зонд для выявления и идентификации ФПК иэ подгрупп японского энцефалита, лихорадки денге и желтой лихорадки, который значительно облегчает задачу по получению коммерческих тест-наба ров для д.явления и идентификации Флавивирусов,мент для выявлен ПК сконструирова известных нукле ьностей геномов флд Ви Ви русов. Пр нуклеотидов от 3 наружена последо еотидов, идентич ованных ФПК (вирэнцефалита, вируса Западного Нила, энцефалита долины Мюрреи, вируса желтой лихорадки, вируса лихорадки Денге(5) -3 ) СОАСАССУБАСАССАСАССС.Синтезированный фосфитамидным ме"тодом предлагаемый фрагмент НК, комплементарный выявленнои последователь 10ности, испытан с целью его примененияв качестве зонда для выявления и иден.тификации ФПК, Для испытаний используют штаммы вирусов, полученные изГосударственной коллекции вирусов Института вирусологии им. г.И.Иванского и, следовательно, отличные от эталонных, полученных эа рубежом.П р и м е р 1, Синтез дезоксиолигонуклеотида - фрагмента НК.Фрагмент НК синтезируют в количестве 1-10 оптических единиц (о,е,)на автоматическом синтезатора Фосфитамидным методом используя в качестве мономеров 5 -О-диметокситритил-М-ацил-(Р-метилдиизопропиламид) фосфаты нуклеозидов. Чистоту полуценных НК проверяют электрофорезом в 20-ном денатурирующем полиакрилвмидном геле. Синтезированный дезоксиолигонуклеотид был не менее 80-нойчистоты. Структуру фрагмента подтверждают анализом по Максаму-Гилберту,П р и м е р 2. Испытание полученного фрагмента НК в качестве зон,да для выявления и идентификации комариных флавивирусов.Вирусы, В работе используют ви" русы, полученные из государственной коллекции вирусов при Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского. В качестве вирусного материала используют мозг зараженных мышей. Белых беспо" родных мышей массой 6-8 г заражают в мозг 0,03 мл суспензии вируса, со - держащей около 6,0 1 в ЛД . вируса. Животных, забивают при появлении клинических симптомов заболевания на 4-7 сут от момента заражения. Иозг препарируют и хранят при -40 С. ВР :качестве образцов для анализа берут суммарную РНК мозга.Выделение суммарной РНК мозга. Суммарную РНК выделяет экстракцией горячим кислым Фенолом (60 фС,. рН 5,2) в присутствии додецилсульфата натрия55 (0,5-1,0 мас. объем) с последующим спиртовым осаждением. Осадок РНК собирают центрифугированием 30 мин при 6000 об/мин, Осадок растворяют вбуфере 7,5 Ф формальдегид - 1 О мй натрий фосфат, рН 7,0, и определяютконцентрацию РНК спектрофотометрически, принимая 1 о.е. Аь= 40 мкг РНК,Иммобилизация РНК на нитроцеллюлозных фильтрах. РНК денатурируютпрогревом в 7,5 ь-ном растворе формальдегида 15 мин при 56 фС, затемдобавляют раствор 20ЯЯС (3,0 Инатрий хлорид - 0,3 М натрий цитрат,рН 7,0) го концентрации 1 ОЯЯС и образцы РНК наносят на нитроцеллюлозные Фильтры. Фильтры сушат при комнатнсй температуре 15-30 мин, а затем в вакуумном сушильном шкафу 2 чпри 80 фС.Мечение олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды метят с помощью полинуклеотидкиназы Т 4 (13) в присутствии= зР-АТР (1000 Ки/ммоль) до удельной активности 500-1000 Ки/ммольолигонуклеотида.Гибридизация, Нитроцеллюлозныефильтры с иммобилизованными препаратами РНК инкубируют в гибридизационной смеси состава: 6 ЯЯС, 2,5раствор Денхарта, 0,5 (масса/объем)додецилсульфат натрия, 200 мкг/млденатурированной и ФрагментированнойДНК быка при 65 С в течение 1 ч. Затем добавляюг ьР-меценый олигонуклеотид (0,2-0,5 пмоль/мл) и гибридизуют 6-18 ц при 45 С. Радиоактивность, связавшуюся с фильтрами, выявляют радиоавтографией на рентге"новскую пленку с усиливающим экраномили просчетом радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном счетчике,Положительными принимались сигналы, превышающие уровень фона отрица"тельного контроля в 2-3 раза .Для подтверждения высокой специ- "фичности полученного зонда испыта-.ния проведены на ряде Флавивирусов,перечень которых и условные обо"значения приведены в табл,1,Результаты дифференциальной детекции Флавивирусов с помощью синтетического зонда-Фрагмента НК приведены в табл.2,Как видно из табл,2, зонд, комплементарный геномнрй РНК комариных Фла-; вивирусов, реагирует в наибольшей степени с флавивирусами подгрупп японского энцефалита и Денге. Реакция зонда с Флавивирусами комплекТабл и цащ ещ 1 О Вирус Омская геморрагическая лихорадка ОГЛ Киасанурская леснаяболезнь КЛБ Нег Не гиви25Лангат Лан Повассан Шотландский энце.Фаломиелит овецЗО ШЭО Вирус ЗападногоНила35Энцефалит долиныМюррей ВЗН ЭцМ ЭСЛ ЭнцеФалит СенщЛуиВирус японскогоэнцефалита ВЯЭ Подгруппа Денге 45 ВиРУс Денге 2 Лен Гибридизациями имп/мин (Ф), по опыту Вирусв ей т ав ав ав т т а а аа т т е щ е щ щ ав т ще е а ГКомплекс клещевого энцефалита 89 (2,9)89 (3,2) 86 (3,1) 85 (3) 83 (3) 80 (2,9) ВКЭ ОГЛ КЛБ Нег Лан 91 (3)88 (2,9)92 (3)91 (2,9) 51 бса клещевого энцефалита, которые пе реносятся клещами, незначительна ине превышает 8,3 (вирус Повассан)от уровня реакции с ВЯЭ,Высокую производительность предлагаемого метода иллюстрируют данные повторных экспериментов с двумяпрепаратами зонда. Оба препаратавысокоспецифично реагируют с комариными флавивирусами с близким уровнем гибридизации (301 Р и 2767 импlминдля ВЯЭ в опытах 1 и 2 соответственно). Уровень гибридизации с вирусами комплекса клещевого энцефалита варьирует незначительно и непревышает 8,3 и 8,8 Ф (вирус Повассан) в опытах относительно эталонного вируса японского энцефалита,При этом использование предлагаемого фрагмента НК для выявления иидентификации ФПК обеспечивает спевдующие преимущества.";имеющиеся в. настоящее время автоматические синтезаторы олигонуклеотидов позволяют просто и быстро получать любые фрагменты НК длиной до 30-70 нуклеотидовпри получении зонда исключается работа с вирусами, обеспечивается возможность получения зондов практически в любых необходимых количествах,в отличие от моноклональных антителвозможен контроль зонда путем проверки его химической структуры, в отличие отмоноклональных антител возможно прогнозирование специфичностизонда, появляется возможность решения задачи по получению коммерческих тест-наборов для выявления иидентификации большого числа флавивирусов.Формула и зоб ретенияФрагмент нуклеиновой кислотызонд для выявления и идентификацииФлавивирусов, переносимых комарамиразмером 20 нуклеотидов, синтезиро 78837ванный хинин".: ги . использованием в качестве мономеров модифицированных защищенных дезоксинуклеозидов и характеризующийся следующей нуклеотидной последовательностью: 51 -с 1 СССТСТССТСТААССТСТАС,Комплекс клещевого энцефалита15Вирус клещевого энщ.цефалита, штаммСофьин ВКЭ Подгруппа японского энцефалита еееетее ввв ва Таблица 2 авВирус Еиае ее 250 (8,3) 243 (8,8)121 (4) 111 (4)Подгруппа японского энцефалита3018 (100) 2767 (100)2324 (77) 2269 (82)2113 (70) 1799 (65)2052 (68) 1743 (63)Подгруппа Денге2686 (89)" ,90 (3) Пов ШЭО ВЯЭ ВЗН ЭДМ ЭСЛ 2601 (94) 89 (3)цен 2Контроль Гибридизация приведена в количестве радиоактивности (имп/мин) и в Ж относительно ВЯЭ. ,.ффРНК нормального мозга мыши. О Составитель Е. Кузнецова Техред ЛаОлийнык .,Редактор Н, Козлова Корректор Н.Ревская Заказ 3990 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-издательскии комбинат "Патент", гтУжгород, ул. Гагарина,191