Способ получения изотиурониевых галогенидов

(51) 4 С 07 ОМИТЕТ ОТКРЫТИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ЕН ПАТЕНТ Изобролучени нениями, близк ют более высок сравнению с сопо структуре, имактивность. мер ил-а номе К - С(0,12ционндо кипванинобрат30 ми вооп дейс Ц рабо(71) Перемартони Ведьипари Валлалат (ШЗ)(72) Чаба Вертеши, Аттила Молнари Лайош Гуцоги (Н 11)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТИУРОНИЕВЫХ ГАЛОГЕНИДОВ(57) Изобретение касается производных тиомочевины, в частности способа получения изотиурониевых галогенидов общей формулы 1: НМ-С(МН)052/23-04Н 11 85/00022 (02,04,85 ение относится к способуновых иэотиурониевых галощей формулы-С-ЮН-С=Я-В 3 Н 1 1 2 Н 8 - В азанные соединения обладаю левым и иммуностимулирую ью изобретения является раза способа получения новых иэо-МН-С (ЯК ) = М-КНХ, где К, - С, салкил 1 замещенный оксигруппой 1 С 2, - алкенил; К- Н, Х - галоген, обладающий противоопухолевым и иммуностимулирующим действием, Цель изобретения - создание новых более активных соединений укаэанного класса.Синтез ведут взаимодействием соединений общих формул 11 и 111: НМ-С(МН)-МН-С(Б)-МНКНХ (11) и К,На 1 (111), где К Ки Х - указанный выше; На 1 - галогенНовые соединения имеют сильное или среднее противоопухолевое и иммуностимулирующее действие при низкой токсичности (Ы = 2380-2860 мг/кг -5 оперорально или 320 мг/кг - внутрибрюшинно), против средней активности и токсичности для известного соединения. 7 табл,1. Получение М амин ил-изотиуроний броида,К 50 мл безводного этанола добаяют 14,9 г (0,05 моль) карбоната-аминоиминометил-тиомочевины, К пученной суспензии добавляют 14,5моль) бромистого аллила, Реаую смесь медленно нагреваютения при энергичном перемешиРеакционную смесь кипятят сным холодильники в течениен и охлажден гкомнатнойемпературы, Си си Ли и,труют для8384 50 55 3 149 удаления выпадающего в осадок вещества, Фильтрат выпаривают под вакуумом и маслянистый остаток кристаллизуют иэ этилацетата, Выпадающие в осадок кристаллы фильтруют и высушивают при 40-50 С, Таким образом получают 19,6 г целевого соединения с выходом 82% и т. пл, 123-125 С,Вычислено %: С 25,10; Н 4,60;23,43; Б 13,39; Вг 33,47.Найдено, %: С 25,07; Н 4,61;23,48; Б 13,32; Вг 33,50.Характерные пики в ИК-спектре: 3290, 3260, 2160, 3105, 1640, 1605, 1550, 1375, 1090, 980, 910, 705, 650П р и м е р 2, Получение М-аминоиминометил-Б-аллил-изотиуроний хлорида.К 50 мл безводного этанола добавляют 14,9 г (0,05 моль) карбоната Б-аминоимииометил-тиомочевины. К полученной таким образом суспензии добавляют 9,18 г (0,12 моль) хлористого аллила и реакционную смесь медленно нагревают до кипения при энергичном перемешивании. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч и охлаждают до комнатной температуры. Смесь фильтруют для того, чтобы удалить возможное выпадающее в осадок вещество, Фильтрат выпаривают под ваку-, умом. Маслянистый остаток кристаллизуют из этилацетата, Выпадающие в осадок кристаллы отфильтровывают и высушивают при 40-50 С.Продукт может быть перекристаллизован следующим образомК 60 мл смеси этанола и металона в соотношении 5:1 добавляют 10 г Н-аминоиминометил-Б-аллил-иэотиуроний хлорида Неэначителвное количество нерастворившихся кристаллов удаляют фильтрованием горячей смеси, Фильтрат очищают от примесей с помощью актинированногодревесного угля, если это необходимо. Прозрачный фильтрат охлаждают до комнатной температуры, в результате чего выпадают в осадок белые кристаллы, Смесь охлаждают до 0-5 С, ее оставляют при этой температуре на 1 ч и фильтруют Кристаллы промывают с помощью этанола, охлажденного льдом и высушивают при 40-50 С. Получают 8,1 г целевого продукта с выходом 81%, Т, пл, 123-125 С. 10 15 20 25 30 35 40 4Вычислено, %: С 30,84; Н 5,66;28,79; Б 16,45; С 1 18,25,Найдено, %: С 30,88; Н 5)61;И 28,78; Б 16,49; С 1 18-27.Данные ИК-спектроскопии аналогичны, как и для бромида н примере 1,П р и м е р 3. Получение И-аминоиминометил-Б-(2-оксиэтил)-изотиуроний хлорида,К 50 мл безводного этанола добавляют 14,9 г (0,05 моль) карбонатаМ миноиминометил-тиомочевины, К суси. зии добавляют 9,7 г (0,12 моль)этиленхлоргидрина и реакционнуюсмесь медленно нагревают до кипенияпри энергичном перемешивании, Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником н течение 90 мин и охлаждают до комнатной температуры,Смесь фильтруют, чтобы удалить воэможно выпадающее в осадок вещество,и прозрачный фильтрат выпаривают подвакуумом. Маслянистый остаток кристаллизуют из этилацетата. Кристаллыотфильтровывают и высушивают при40-50 С, Таким образом получают13,5 г целевого соединения с выходом68% и т. пл. 134-136 С.Аналогично получают И-аминоиминометил-Б-(3-оксипропил)-изотиуронийбромид (соединение 3). Т, пл. 132135 Г, Выход 35,57Вычислено, %: С 23,34; Н 5,06;И 21,79; 0 6,22; Б 12,45; Вг 31,13.Найдено, Е: С 23,35; Н 5,04;И 21,81; Б 12,51; Вг 31,20,Характерные пики в ИК-спектроскопии следующие: 3590, 3300, 3220,2925, 1680,Биологическая активность соединений указанной общей формулы доказана следующими испытаниями,Испытание специфических действий.Иммунологические испытания,Лимфоциты. Лимфоциты отделены наФикол-Уромиро градиенте (Воуцш 1968)из крови здоровых доноров и пациентов, страдающих опухолью лимфатических узлов (злокачественной лимфой)и метастазирующими твердыми опухолями соответственно. При подборе пациентов, принадлежащих к последнейгруппе, принимается во внимание цитоксичность клетки зависимого антитела (АДСС) и ЮК-активность. Фагоцитыудалены обработкой порошкообразнымжелезом и магнитом, 1498384АДСС, АДСС определена следукопм образом,Эритроциты цыплят, меченые с 10Сг и покрытые сывороткой кролика против зритроцитоэ цыплят, инкубированы вместе с лимфопитали в теочение 4 ч при 17 С, Реакция, вызывающая прекращение активности плавающих на поверхности центрифугирован 1 О 5 2025 30 35 40 45 5055 ных клеток, определена в счетчике гамма-излучения. Степень освобождения хрома выражена в виде индекса цито- токсичности (ИЦ, 7). (см, табл, 1).ХК. ИК-активно с ть определена сле дующим образом.Опухолевые клетки К, меченые Сг, инкубируют вместе с эффекторными клетками в ТС 199 жидкой питательной среде, содержащей 107 декомплементарной Са 1 Г в сыворот. Реакция, останавливающая радиоактивность плавающих на поверхности центрифугированных клеток (освобождение хрома), подсчитана в счетчике гамма- излучения, Уничтожение меченых клеток (ИУ, 7) выражено в виде различия испытуемого освобождения и спонтанного освобождения хрома.Статистические вычисления проведены посредством испытания с одним образцом, Соединения 1, 2 проявляют значительное иммуностимулирующее действие, Указанные соединения способны значительно увеличивать нормальную и сильно пониженную ИК- и К-клеточную активность, даже выше нормального уровня, Указанное действие может быть настолько сильным, что цитотоксическая активность, пониженная до 1/10 первоначального значения, может быть восстановлена до первоначального уровня (табл, 2),В пределе дозы, соответствующей ожидаемой концентрации плазмы человека, соединения увеличивают ИК- и К-клеточную активность лимфоцитов человека и повышают цитотоксичность природной клетки посредника (ИСМГ-) и АДСС-реакцию соответственно со скоростью, зависящей от дозы. Согласно предварительным результатам дополнительных щмунологических испытаний соединения увеличивают бластопреобраэонание и миграцию,Миграция лейкоцитов.Спонтанная миграция лейкоцитов измерена на микрокаплях агарозы.2 мл капель агароэы (0,27) помещают на пластины для миграции. Добавляют ТС 199 жидкую цитате.гьную среду и плотно закрывают пластины длядоступа воздуха. После 24 ч изменяют площадь миграции (мм ) с помощью стереомикроскопа,Миграция лейкоцитов,Беспорядочная миграция полиморфонуклеарных клеток здоровых доноровувеличена с помощью соединений, полученных согласно примерам 1, 2. Оптимальная доза достигает 1,0 р г/мл.При более высокой дозе (10 р г/мл)действие менее выражено.В табл. 3 представлено дп чд 1 годействие на направленную(беспорядочную) миграцию полиморфонуклеарныхлейкоцитов человека,Бластопреобразование, индуцируемое митогеном.Лимфоциты выращивают в ТС 199 жидкой питательной среде, содержащей 107 декомплементарной са 1 Е-сыворотки, антибиотики и 25 мН НЕРЕБ (Бегча). 200 1 чл клеточной суспензии, содержащей 2-10 лимфоцитов, наносят на микропластину, пят: параллельных опытов проводят каждый раэ.К культурам добавляют 2 и 10 р г/мл соответственно фитогемагглютинина (лейкоагглютинин) и 25 рг/мл конканавалина А (сагЬо сЬеш); указанные величины относятся к конечной концентрации. Культуры выращивают при 37 С в течение 72 ч. За 8 ч до окончания конца периода выращивания к образцам добавляют 0,5 Р С 13 Н-тимидина и завершают замораживание культур, После расплавления образцы фильтруют на автоматической сборочной машине (ЭуцаСесЬ), Радиоактивность образцов измерена в сцинтилляционном счетчике, Активность выражена в виде с,р,м,(табл. 4 и 5). В табл, 4 и 5 представлено п чъСго действие на бластопреобраэование лимфоцитов человека,стимулируемое с помощью фитогемагглютинина (РНА) и конканавалина А(СопА),Статистический анализ.Важность определена с помощьюиспытания 2 Т 2 с одним образцом,Результаты, полученные с продуктомреакции из примера 1, представленыв табл, 1 - 3.Отсутствует СреднееСильное (ингибирование) Повышение иммунной системы организма оценено на основе количества и активности нейтрофильных гранулоцитов, лимфоцитов и макрофагов, появляющихся среди асцитных опухолевых клеток и принимающих участие н имФмунной системе, Активность иммунной системы проявляется также по скорости, при которой указанные клетки в асците образуют плазма-мостиконую связь с опухолевыми клетками, Согласно этой оценке, если отсутствует различие по числу и актинности указанных клеток, то можно заявить, что50 отсутствует повышение над контролем, Среднее действие наблюдается, если повьппение числа клеток или активнос - ти над контролем достигает до 20%. Действие является сильным, если поньппение числа клеток и активности иммунной системы составляет более 207. контроля (табл. 7). Предварительное быстрое испытание для определения протиноопухолевого иммуностимулирующего действия,Мыши-самцы вида СРЬР (средний5 живой нес 30 г) ннутрибрюшинно заражены 4 млн клеток асцитной лимфомы.При испытании использованы те животные, у которых на четвертый день о бразовалась легко наблюдаемая опухоль, те, асцит. В каждой группе использованы по крайней мере десять животных, и мьппи были орально обработаны 1/10 величины ЬПСпустя 24 ч после оральной обработки оценены результаты посредством окрашенного асцитного мазка (посева) Гиемса на основе цитологического анализа, Как и н обработанной группе, в контрольной группе использовано то же количество животных. Оценены повреждения опухолевых клеток, активация организма и возможные токсические действия (табл, 6). 25При оценке противоопухолевого действия оценено процентное соотношение уничтоженных и неповрежденных опухоленых клеток. Результаты выражены по следующей шкале: 30Уничтожение опу- Действиехоленых клеток, 70-3030-7070-100 Токсичность определена путем оценки морфологических изменений гранулоцитов и лимфоцитов, васкулязации плазмы, фрагментации клеточного ядра, образования полисегментов и токсической грануляции Токсичность выражена по следующей шкале;Наблюдаемые результаты ТоксичностьОтсутствуют указанные изменения ОтсУтствУетн имеющихся клетках 207-ное изСредняяменениеИзменение превышает 207 ВысокаяИспытание противоопухолевогодействия.1 п чг.Сго.Кклетки человеческой эритролейкемии и Рклеточные культурылимфомы мьппи обработаны с 1100 р г/мл испытуемого материала,1 п ч 1.чо.А. ИКу-асцитная лимфома.1 млн клеток асцитной лимфомыНемет-Келнера внутрибрюшинно трансплантированы в 20 мьппей-самцов нидаОР 1.Р (средний живой вес 30 г)(новая асцитная опухоль мьппи использована в качестве средства дляскрининга), Половина животных служила н качестве контроля, а другаяобработана с 1/10 величины Ю 5 п различных соединений перорально ивнутрибрюшинно н первый и пятый последовательные дни соответственно.Если 1/10 величины 1.Рэффективна,была использована более низкая доза,В группе, подвергнутой одной обработке, цитоморфологическое определениеасцитного мазка проведено после 24 чи сделано соотношение поврежденныхи уничтоженных клеток соответственно, В группах, обработанных в течение 5 дней, определен процент ныживания,Б, 1. опухоль.0 клеток 1 1 г еопнхоли трансплантиронаны внутрибрюшинно в 20 мьппейсамок вида ЛДР, весом 20 г, Обработка начата спустя 24 ч после трансплантации опухоли и продолжена в течение 8 дней. Каждая группа состоит из 5 животных; доза 5, 50 и 500 мг/кг перорально ежедневно. Контрольная группа также состоит из 5животных Определен процент вьщивания.В, Длинная опухоль Люиса,В каждой группе использованы 6 животных. Доза; 5 и 50 мг/кг, Контроль 5 ная группа также состоит из 6 животных. В испытании использованы мыши-самки вида СэВ 1 (нес 20 г).Опухоль подкопно трансплантирована в мышцу правой ноги, После 10 дней нога ампутирована, оральная обработка начата и продолжалась в течение 9 дней, Животные умерщвлены и метастазы подсчитывались под сте 10 реомикроскопом.Г. Собаки, принадлежащие к различным видам и имеющие спонтаннуюопухоль молочной железы (австрия СС),обработаны в течение 4 недель с1-10 мг/кг оральными дозами испытуемых материалов. Осуществлено вырезание для испытания образцов тканей,для гистологического анализаСоединение согласно примеру 1проявляет значительное противоопухолевое действие, так как ингибируетклетки человеческой эритролейкемииКв тканевой культуре при концентрации 4 р г/мл, Кроме того, это30соединение ингибирует распространение Рклеток только при концентрации 40г/мл, а когда увеличивают концентрацию до 400 р г/мл, активность не повышаетсяУказанное соединение значительноуменьшает количество метастаэов легких в длинной опухоли льюиса придозе более низкой, чем 1/10 велич ины 1 ЛВыявлено, что действие может бытьусилено до значитольного большей степени путем повторения обработки, нежели увеличением дозы,Соединение по примеру 1 является45активным против ИКу-асцитной опухоли при концентрации ниже 1/1 О величины 1.Р, Это соединение проявляеткьиммуностимулирующее действие при малых дозах, при более высоких дозахпоказывает направленное противоопухолевое действие, Так, соединениепроявляет иммуностимулирующее действие при дозах 25 мг/кг и являетсяцитотоксичным при пределе доэ 250500 мг/кг, Оно высокоактивно противспонтанной опухоли молочной железыу собак. 11 ри биопс,ии, взятой послеобработки, проведспной в течение 34 недель, клеточная инфильтрация инваэивного характера обнаружена в опухолях (досСив СС), состоящих из лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, макрофагов и эпизодически эозинофильных гранулоцитов. На опухолевых клетках обнаружены дегенеративные изменения и сильная декомпозиция,МК-клетки образуют плазма-мостиковые связи с опухолевыми клеткамии это вызывает вауколярную дегенерацию (вырождение) плазмы опухолевыхклеток и большое прореживание в РИЗрасположении клеточного ядра, Соотношение клеточное ядро - плазма изменяется, клеточное ядро сильно набухает и баэофильность - способностьклеток воспринимать только основныекрасящие вещества плазмы - уменьшается.Примерно в 1/4 случаях лейкоцитная инфильтрация в опухоли является незначительной; с другой стороны,опухолевые клетки набухают и гиалиниально дегенерируют, В межклеточномпространстве отлагается весьма большое количество гиалиноокрашенногоматериала.При оральном приеме соединенияпримера 1 при ежедневной дозе 30120 мг (0,5 - 2 мг/кг) в течение6-12 мес отмечено значительное улучшение состояния или выздоровление вслучае метастаэов, опухолей молочнойжелезы, опухолей половой железы женщины и опухолей поджелудочной железы человека,Испытание противоопухолевого действия в сочетаниях,Сочетание с известными цитостатическими веществами.Различные цитостатические вещества, имеющие биологическое алкилирующее действие, введены вместе с полученными соединениями мышам видаСГ 1.Р, имеющим ИКу-асцитную опухоль Цитостатические вещества быливведены орально, внутрибрющинно иливнутривенно при доэе, соответствующей 1/5 или 1/10 величины ЕРилив наиболее эффективной дозировке.Полученные соединения введены орально при дозе 1/10 или 1/20 величины1.Л один или несколько раз спустя48 ч после обработки цитостатическим веществом, Таким образом введены сочетания циклодюсфамида, карно2 1 1498384 мустина, дегранола, дибромдульцита формула и дибромманита, и соединение примера 1, По сравнению с контрольнойгруппой, обработанной только извест 5 ным цитостатическим веществом, противоопухоленое действие усиливается, а иммунодепрессия уменьшается.Сочетание с известными витаминами.Изотиурониевые галогениды могутбыть скомбинированы со средними дозами витаминов А и П и с высокимидозами витамина С. Хорошие результаты получены как при фармакологических испытаниях, так и при клинических случаях на людях.Сочетание с известными гормонаизобретения 11 Н - С - н - С = 1 - К 2 Нх1ИН 8-Кми. При обработке опухолей, зависимых от гормонов, сочетание, как было доказано, является полезным как при фармакологических испытаниях, так и при клинических случаях на К,На 1 Действие на АДСС, средние значения ф Я Е; ИЦ, 7, при обработке соединением 1 (мол. вес. 194,7) дозой, мольлюдях.Использование в хирургии.Полученные соединения использованы при фармакологических испытаниях в случае твердых опухолей до и после хирургической обработки (ИКу твердая, Йоисда). Способ получения изотиурониевыхгалогенидов общей формулы где К- С, -С-алкил, замещенныйоксигруппой, С-С-алкенил;К- водрод;5Х - галоген,о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтосоединение общей формулы 20 МНг-С-Щт-С-ММ 2 НХ 11ЯИ Я где Ки Х имеют указанные значения,подвергают взаимодействию с соединением общей формулы где К, имеет указанные значения. Таблица4Таблица 2 13 1498384 Группа (количество случаев) Контроль Нормальная ЮК 32,9+2)5 41 12,9Таблица 3 Контроль О,1 1,0 10,02+1,65 П р и м е ч а н и е. Средние значения от семи здоровыхконтрольных доноров: ф Б.Е.М.фНе важныеВажные (р с 0,01)ФФФВажные (р ( 0,05)Таблица 4 Контроль Митогенныйреагент, рг/мл 1,0 10,0 0,1 29959+4051 10545+3414 П р и м е ч а н и е. Здоровые контрольные пациенты нормальной реактивности; и = 6.Площадь миграции, мм , при дозе соединения 1,2"/"л+Б.Е.М. при дозе, 1 г/мл 0,1 1,0 10,0 СоединениеРНА, 2 4344+1153 ,471611287 П р и м е ч а н и е, Пациенты пониженной реактивности (опухольи Б 1 Е); и = 6. Таблица 6 тЛМГ/14 динения Перорально Внутрибрюшин- но 2380320 2860 т 180 320+30 Таблица 7 Иммуности- Токсичесмулирующее кое дейдействие ствие Противоопухолевые действия Соединения 1 Сильное3 СреднееИзвестное М Соединение формулы где К 1 - СН , К- Н Составитель М, Меркулова Техред Й,яндык Корректор М, Максимишинец Редактор О, Спесивых Заказ 4463/58 Тираж 352 Подписное ВНИИА Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5