Способ получения n-ацетилмурамилпептидов

СОЮЗ СОЕЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСК СПУБЛИК А 61 К 37/ ьо 4 СО)фъ 1 ь,РЕ ГЕ ИСААКИЕ се тЬаг ргос 1 цсСдоп Кея., 1977, (54) СПОСОБ МИЛПЕПТИДОВ (57) Изобре пептидов, в иэводных И- общей форму К" СЮ)ХННСН-СЮ)0(снда Нах-С-о,с щ ЮНС(О)Щ,где К 1 - Н, 1,-серил, 1 - обладают им ностью и биологииболее акткласса. Пол нения форму( .-алкил; Х аланил, которыеирующей активспольэованы в Цель - соэдани в указанного ведут иэ соеди и изо ил, 1, остим ть могу и ме ивны ицине. вещес ние МП0 Мили ф 0)СН Н 3 С-СН-С(0 о)1 ОСУДАРСТВЕННЬЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Ажанс Насьональ де Валориэасьонде ля Решерш (АНВАР) (ГК)(72) Пьер Лефрансье, Моник Паран,Франсуаз Одибер, Луи Шедид, Жан Шоайи Эдгар Ледере (ГК)(56) Ояаъта Т., Леап 1 ог К.И. Бгегеозе 1 есгдче БупгЬевдя оЕ 2-ащдпо-0(Э-сатЬохуегЬу 1)-2-деоху-81 цсове(Мцтащдс АсЫ). - 3. Огя, СЬещ., 1965,ч. 30, У 2, р. 448-450,Е 11 оця Г., Айащ А., СдогЬагц К.,1.ес 1 егег Е. Мдпдща 1 ягтцстцга 1 тес)цдгещепгя Гог ай 3 цчапт астдчдсу оГЬастегда 1 рергЫор 1 усап с 1 егдчагдчев. -ВдосЬещ. В 1 орЬув. Кея. Сошшцп., 1974,ч. 59. У 4, р. 1317-1325.Ндтата А,А., Вгапдгдвя М.Ч. Развдче Ьеща 881 цгдпагдоп ргосейцгев Еогргогедп апд ро 1 увассЬагЫе апдяепяцядпя егутЬгосутев ягаЬд 1 дяес 1 Ьуа 1 с 1 еЬусаев. - .1. 1 щшцпо 1 ояу, 1968,ч. 100, Р 3, р. 641-646.СЬес 1 дс 1 1 Рагапг М., Рагапй Р.,1.ейгапсдег Р., СЬоау д., Ьес 1 егег Е.ЕпЬапсешепт оГ попяресдтдс дщшцпдйусо К 1 еЬяде 11 а рпецшопдае дпйесГдоп Ьуа яупгЬегдс дшшцпоаЪ 3 цчапС (Ы"асейу 1 шцгащу 1-1.-а 1 апу 1-П-дво 81 цгашдпе) ярдяечега 1 апа 1 оея. - Ртос. Бай. Асас 1,Бсд. П. Б.А., 1977, ч. 4, У 5, р.20892093.1.егпег К,С., Со 1 йягедп К. Сцшшдпдя С. Епс 1 отохдп дпс 1 цсес 1 с 1 дввешдпа 1 ес 1 дпггачаясц 1 аг с 1 огйдпр: ечЫепв щес 1 дасес 1 Ьу пецгторЬд Г гдвяце тассог. - Тгош ч, 11, В 2, р. 253-261. ПОЛУЧЕНИЯ И-АЦЕТИЛМУРАение касается эамещенныхчастности получения процетилмурамилпептидов (МП)ы где РЬ - фенил д - Н -МЭ 9 С К - бенэил; К - указано вышее. Затем каталитически гидрируют в присутствии 60%-ной.СНСООН (удаляется защитная бензилиденовая группа). Испытания МП показывают, что они обладают высокой иммуностимулирующей активностью в сочетании с низкой пирогенностью и чрезвычайно низкой токсичностью. 5 табл.1326 197 10 Изобретение относится к способуполучения новых биологически активныхМ-ацетилмурамилпептидов общей формулы СВЕОНИ, ОН 1,с( ц ПИ р гНОсн, - сн нсоснСО-Х-МН - СН-СООВ 1СН,СН,СОЛОН где Х - Ь"аланил, Ь-серил, Ь-валил; 15В - линейный или разветвленныйС-С-алкил,которые могут найти применение в медицине.Цель изобретения - получение новых 20биологически активных Б-ацетилмурамилпептидов, обладающих иммунорегулирующими свойствами в сочетании снизкой пирогенностью.П р и м е р 1, Метиловый эфир Иацетилмурамил-Ь-аланил-П-глютамина (1),а) Метиловый эфир И-трет-бутилоксикарбонил-глютамина (11).К раствору 1,5 г (6,2 ммоль) Итрет-бутилоксикарбонилг-глютамина в ЗО60 мл абсолютного метанола при 0 Сприбавляют по каплям раствор диазометанав эфире до появления желтойокраски у реакционного раствора, перемешивают реакционную смесь 10 мин при0 С и 10 мин при комнатной температуре, Ход реакции контролируют с помощью тонкослойной хроматографии(ТСХ) на пластинках с силикагелем сиспользованием систем растворителейгн-бутанол - уксусная кислота - вода(4; 1.:5), н-бутанол - пиридин - уксусная кислота - вода (30:20:6;24) ихлороформ - метанол (5: 1), После окончания реакции избыток диазометанаразлагают добавлением уксусной кислоты. Затем реакционную смесь упаривают досуха, остаток растворяют вминимальном количестве этилацетатаи продукт осаждают из раствора добав лением петролейного эфира.В итоге гголучают 1,42 г (89,77соединения (11) с .т,пл. 86-90 С,Ы)= +24,7(С = 1; метанол).Найдено, 7.: С 50,62; Н 7,75;55В 10,82,Рассчитано, 7; С 50,76; Н 7,75;И 10,76. 2б) Метиловый эфир И-трет-бутилок-фсикарбонил-Ь-аланил-Тг-глютамина (111).1,4 г (5,4 ммоль)соединения (11)обрабатывают 1 н,раствором солянойкислоты в ледяной уксусной кислоте.Реакционную смесь выдерживают 30 мин,упаривают досуха, остаток сушат ввакууме над КОН и растворяют в 25 млДМФА. К полученному раствору прибавляют 0,6 мл (5,4 ммоль) Б-метилморфолина и 1,86 г (6,5 ммоль) И-оксисукцинимидного эфира И-трет-бутилоксикарбонил-Ь-аланина. Реакционнуюсмесь оставпяют на ночь и затем упаривают досуха. Остаток растворяют всмеси хлороформ - изопропанол - уксусная кислота (100;0,5;0,62) и хроматографируют на колонке (27 х 3 см), заполненной двуокисью кремния, с использованием в качестве элюента системы хлороформ - изопропанол - уксусная кислота (100:5:2). Фракции, содержащие продукт, объединяют и упаривают досуха. Остаток кристаллизуютиз смеси изопропанол - изопропиловыйэфир.В итоге получают 1,035 г соединения (111) с т.пл. 115-116 С;с 3 г=- -9 (С=1; метанол).Найдено, Ж: С 50,79; Н 7,40;И 12,42.С 14 нг,иъоРасчитано, 7,: С 50,74; Н 7,601И 12,68,в) Хлоргидрат метилового эфира Ь -аланилг-глутамина (1 Ч).332 мг (1 ммоль) соединения (111)обрабатывают 3 мл 1 н. соляной кислоты в ледяной уксусной кислоте. Реакционную смесь выдерживают 30 мини упаривают досуха, Полученное в остатке масло сушат в вакууме над КОН. г) Метиловый эфир 1-4-0-бензил,6;0-бензилиден-Б-ацетилмурамил-Ь - аланил-П-глютамина И)471,5 г (1 ммоль) 1-Ы-О-бензил,6;0-бензилиден-И-ацетилмурамиловой кислоты растворяют в 5 мл ДМФА, содержащего 0,11 мл (1 ммоль) И-метилморфолина. К полученному раствору прибавляют при -15 С Ог 13 мл (1 ммоль) изобутилхлорформиата. Реакционную смесь выдерживают 3-5 мин, прибавляют к ней охлажденный до -15 С раствор 268 мг (1 ммоль) соединения (71) и 0,11 мл (1 ммоль) Я-метилморфолина в 5 мл ДМФА. Реакционную смесь выдерживают в течение ночи при -150 С, при 132613бавляют 1 мл 2,5 М раствора бикарбоната калия, выдерживают 30 мин при0 С и прибавляют воду, Выпавший осадок отфильтровывают, промывают 1 Мраствором бикарбоната калия и сушатв вакууме над Р 2 ОВ итоге получают 620 мг (90,57)соединения (Ч) с т.пл, 215-220 С;с(3= +92,6 (С=1; ДМФА).д) Метиловый эфир И-ацетилмурамил-О1,-аланил-глютамина (1).587,6 мг (0,86 ммоль) соединения,(Ч), растворенного в 35 мл ледянойуксусной кислоты, подвергают гидрированию в течение 60 ч в присутствии 5в качестве катализатора 450 мг 57.-ного палладия на активированном угле.Затем катализатор отфильтровывают,фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 0,1 М растворе уксусной кислоты и хроматографируютна колонке (10 х 1 см), заполненнойионообменной смолой "Амберлит АГ5 ОЫ-Х 2") с использованием в качествеэлюента 0,1 М раствора уксусной кислоты. Фракции, содержащие продукт,лиофилизуют и полученный продуктвновь хроматографируют на колонке,заполненной ионообменной смолой"Амберлит АГ 1 Х". Фракции, содержащие продукт, лиофилизуют. В итогеполучают 290 мг продукта, которыйрастворяют в смеси н-бутанол - уксусная кислота - вода (65:10:25) и хроматографируют нд колонке заполнен 35ной силикагелем, с использованием вкачестве элюента системы н-бутанолуксусная кислота - вода (65: 10:25).Фракции, содержащие продукт, объединяют и экстрагируют водой. Воднуюфазу отделяют и лиофилизуют.В итоге получают 234,4 мг соединения (1) с т.пл. 108-112 С;Ыф =)а) И-бензилоксикарбонил,-аланилП-глютамина (Ч 11)552,4 г (16,4 ммоль),В-глютамина растворяют при нагревании в 35 мл воды.К раствору прибавляют 2,3 мл(14,4 ммоль) И-оксисукцинимидногоэфира М-бензилоксикарбонил-Е-аланинав 70 мл безводного тетрагидрофурана.Реакционную смесь выг,:рживают 48 чпри 4 С,прибавляют 0,5 мл (3,85 ммоль)диметиламинопропиламина, выдерживаютреакционную смесьч при комнатнойтемпературе) разбавляют 65 мл водыи подкисляют 4 н.НС 1 при 0 С до рН2,2-3)0. Затем тетрагидрофуран отгоняют в вакууме, а остаток выдерживают ночь при 4 С. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают минимальнымколичеством охлажденной воды и кристаллизуют из этанола.В итоге получают 2,87 г (627) соединения (Ч 11) с т.пл. 179-182 С;,72 -13,3 (С=1; метанол),Найдено, 7: С 54,18; Н 5,80;И 11,77.1 С 2 3 4Рассчитано, 7; С 54)69; Н 6,02;И 11,96.б) н-Бутиловый эфир И-бензилоксикарбонил.-аланил-О-глютамина (Ч 111).350 мг (1 ммоль) соединения (Ч 11)растворают в смеси 15 мл тетрагидрофурана и 5 мл воды. К раствору прибавляют водный 207-ный раствор Сз СО(1 ммоль). Раствор упаривают досуха,остаток растворяют в ДИФА и вновьупаривают, остаток сушат над Р 20 .Эту процедуру повторяют несколькораз, Полученный в итоге сухой остаток растворяют в 30 мл ДМФА. К полученному раствору прибавляют 0,12 мл(1, 1 ммаль) 1-бром-н-бутана, выдерживают 20 ч, контролируя окончаниереакции с помощью ТСХ на силикагелев системе этилацетат - пиридин - уксусная кислота - вода (6:2;0,6:1),добавляют 0,06 мл (0,55 ммоль) 1 бром-н-бутана, выдерживают 20 ч,упаривают до минимального объема и про,дукт осаждают водой.В итоге получают 332 мг (81,57)соединения (Ч 111) с т.пл, 148-150 С.Найдено, 7.: С 58,91; Н 7,12;Я 10,26.СНЮ,О,Рассчитано, 7 С 58)95, Н 7,17И 10,31.в) н-Бутиловый эфир Е-аланил-Пглютамина (1 Х).330 мг (0,8 ммоль) соединения1326197 55%-ного палладия на активированномугле и 1 мл 1 нНС 1, Окончание реакции контролируют с помощью ТСХ насиликагеле в системе этилацетат -пиридин - уксусная кислота - вода(6:2;0,6:1). После окончания реакциикатализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают, остаток сушат в вакууме над Рг О . В итоге получают 254 мг(стадия т), исходя из 0,9 ммоль 1 15О-бензил,6-0-бензилиден-И-ацетилмурамиловой кислоты и 0,8 ммоль соединения (1 Х). В итоге получают соединение (Х) с выходом 81,27, т.пл. 220235 Сес( В= +82,6 (С=1 ДМФЛ), 20Найдено, 7: С 6 1,77; Н 7,03;И 7,03.СН боМО,Рассчитано, %: С 6 1,14; Н 6,93;Б 7,71. 25д) н-Бутиловый эфир И-ацетилмурамил-Ь-аланил-глютамина (Ч 1).472 мг (0,6 ммоль) соединения (Х),растворенного в 30 мл ледяной уксусной кислоты, подвергают гидрированию 30в течение 40 ч в присутствии в качестве катализатора 470 мг 5%-ного папладия на активированном угле. Послеокончания реакции, которая контролируется с помощью ТСХ на силикагелев системе хлороформ - метанол (50:15),катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют всмеси хлороформ - метанол (50;15) ихроматографируют на колонке, заполненной силикагелем(33 г), с использованием в качестве элюента системы хлороформ - метанол (50: 15).Фракции, содержащие продукт, объединяют и упаривают досуха. Остаток 45растворяют в воде, раствор подвергают ультрофильтрации и затем лиофилизуют,В итоге получают 157 мг (487)соединения (Ч 1) с 1, = +34,8 (С=1,уксусная кислота).Найдено, 7: С 48,26; Н 7,08;Ы 9,74.СгНО И Ои 1/3 НОРассчитано,7.: С 48,24; Н 7,50;И 9,78.П р и м е р 3. н-Дециловый эфирИ-ацетилмурамил-Ь-аланил-глютамина(Х 1). 6Проводят аналогично примеру 2. Витоге получают соединение (Х 1) сЯ 1 = +30 С (С=1; ледяная уксуснаягокислота), т.пл. 180 С,Найдено, 7,.: С 53,97; Н 806;.И 8,47,С д Н ИОг, 0,15 СНС 1 .Рассчитано % С 53 )97Н 8 08И 8,61.П р и и е р 4. н-Пропиловый эфирИ-ацетилмурамил-Ь-аланил-П-глютамина(Х 11).Синтезируют аналогично примеру 2.В итоге получают соединение (Х 11) сс 3= +32,3 (С=1; ледяная уксуснаякислота).Найдено, 7, С 44,5; Н 6,30;Ы 8,40.О 0,6 СНС 1Рассчитано, 7: С 44,4; Н 6,40;И 8,40.П р и м е р 5, н-Гексиловый эфирИ-ацетилмурамил-Ь-аланил-Р-глютамина(Х 111).Синтезируют аналогично примеру 2,В итоге получают соединение (Х 111)сЫг= +29,5 (С=1; ледяная уксуснаякислота).Найдено, 7: С 49,4; Н 7,40; Е 9,10.СН 1 4 И ф Ои 03 СНС 1Рассчитано, 7: С 49,6; Н .7,30;И 9,10П р и м е р 6. Этиловый эфир Иацетилмурамил-Ь-аланил-П-глютамина(Х 1 Ч).Синтезируют аналогично примеру 2.В итоге получают соединение (Х 1 Ч) сЯг= +34(С=1; ледяная уксуснаякислота).Найдено, 7: С 46,4; Н 7,1; М 10,3.Ср Нз ЬфО,иРассчитано, %: С 46,4; Н 7,3;М 10,2,П р и м е р 7. н-Пентиловый эфирИ-,ацетилмурамил-Ь-.аланил-В-. глютамина(ХЧ).Синтезируют аналогично примеру 2.В итоге получают соединение (ХЧ) сс 3 гг = +36,5 (С=1; леДЯнаЯ УксУснаЯкислота).Найдено, 7.: С 49,3; Н 7,7;И 9,6.Рассчитано, 7: С 49,4; Н 7,6;Н 9,3. П р и м е р 8. н-Бутиловый эфир И-ацетилмурамил-Ь-валил-глютамина (ХЧ 1),Первичный отзыв 10 0,07 Х 11 10 0,13 Х 111 10 0,03 Х 1 Ч КонтрольМДП 1,64 3,57+ 1,788,34+1,34 8,43+1,52 8,72+1,23 10 0,03 55 3,64 0,23 ХЧ 1 4,21 0,23 ХЧ 11 3,85 Ч 1 Синтезируют аналогично примеру 2.В иТоге получают соединение (ХЧ 1) с1 в= +47,6 (С=1; ледяная уксуснаятокислота),Найдено, 7.: С 50,5; Н 7,5; М 8,6.С НМ О 0,25 СН СООН НОРассчитано, 7: С 50,52; Й ,86;М 8,57.П р и м е р 9. н-Бутилавый эфирМ-ацетилмурамил-Ь-серил-Э-глютамина 10(ХЧ 11).Синтезируют аналогично примеру 2.В итоге получают соединение (ХЧ 11) сЫР= +39,4 (С=1; ледяная уксуснаякислота). 15Найдено, 7.: С 48,8; Н 7,0; М 9,8.Рассчитано, Е: С 48,9; Н 7,14;М 9,9.Полученные М-ацетилмурамилпептиды 20изучены в качестве иммунологическихдобавок,Токсичность М-ацетилмурамилпептидов, полученных сагласно,предлагаемому способу, изучена на кроликахпри парентеральном введении, При этом.установлено,чта токсические дозы изученных соединений значительно вышедоз, при которых обнаруживается ихактивность, Токсические эффекты наблюдаются при дозах, равных или превышающих 5 мг/кг. При определении пирогенной активности изучалось изменение температуры 35 тела у кроликов в течение 3 ч после введения М-ацетилмурамилпептидов, Полученные результаты представлены в табл. 1. Из приведенных в табл. 1 данных можно сделать вывод а там, чта в дозах., при которых проявляется активность предлагаемых соединений, они не обладают способностью вызывать лихарадачные явления.При определении активности в качестве иммунологических добавок в водной Фазе изучено влияние,М-ацетилмурамилпептидав, получаемых согласно предла-, гаемому способу, на количество антиальбуминавых антител. Группам по 8 мышей швейцарской породы возрастом 2 мес вводят подкожна 0,5 мг антигена состоящего иэ бычьего сывароточнога альбумина без или с добавкой изучаемых соединений в изотаническом солевом растворе в количестве 0,1 мг. Антиген без добавки изучаемых соединений служит контролем. Спустя 30 дн мышам вводят подкожно тот же антиген в дозе 0,1 мг, Одновременно для сравнения исследуют воздействие в качестве иммунологической добавки известного иммуностимулятора - 2-(2-ацетамидо-дезакси-0-П-глюкопиразанил)-0-прапионил-Ь-аланил-иэаглютамина (МДП).Количество антител определяют пассивной гемагглютинацией с использованием эритроцитов баранов, обработанных формалином и покрываемых изучаемыми антигейами, Исследования проводят после первой инъекции антигена и после повторной инъекции для определения первичногаи вторичного иммунного отзыва.Показатели количества антител выражают через логарифм с основанием 2 максимального разбавления сыворотки, агглютинирующей определенное количество красных кровяных телец крови баранов. Полученные результаты представленыв табл. 2Таблица 21 О Титр антител Соединение Вторичный отзывПерв ичныйотзыв 3,64 4,64 Х 1 9, 1,0+1,66 Таблица 3 Х 11 9,52+0,50107,71+1,67 Количество антиСостав эмуль. Диаметр 2,75 4,64 Х 111 сии, содержащеи антиген раздражения, мм Х 17 9,53+0, 93 7,80+1,39 тел,мкг/мл 1,64 2,64 3,64 ХЧ 1 7,24 800 НАФ 0 ХЧ 11 8,01 5000 15 НЛФ+МДП НЛФ+ 1 6000 НАФ+ Ч 1 2000 17 9 132619Продолжение табл. 2 Полученные результаты показывают, что предлагаемые соединения, вводимые в солевом изотоническом растворе, вызывают заметное увеличение количества образующихся антител.При определении активности в каче стве иммунологических добавок в масля ной фазе, изучалось увеличение коли-чества специфических антител, вырабатываемых антигеном, после его введения в присутствии добавок исследуе мых соединений, вводимых в видеэмульсии вода в масле. Опыты проводят на морских свинках-самках весом 350 г (группы по 6 особей). Препараты вводят подкожно в подушечки обеих задних лапок, Овальбумин из расчета 1 мг в Виде эмульсии 0,1 мл изотонического солевого раствора в масляной форме, состоящей из неполного адьюванта Фрейнда (НАФ), Исследуемые соединения вво дят в количестве 0,1 мг в виде добавки к эмульсии, содержащей НАФ. Для;сравнения проводят опыты с использованием в качестве добавки МДП. Через 18 дн после иммунизации исследуют возможные проявления заторможенной сверхчувствительности по отношению к антигену, дпя чего вводят подкожно в бок животного 0,01 мг овальбмина, и через 48 ч наблюдается реакция в мес" те введения овальбумина, размер вызванного .раздражения измеряют в милли.метрах. Через 21 день после инъекции животным пускают кровь и измеряют в полученной сыворотке содержание антител,. специфических по отношению к овальбумину, в результате осаждения комплекса антитело - антиген в зоне равновесия. Количество белкового азота, содержащегося в осадке, определяют по методу Фолина.Средние значения содержания антител приведены в табл. 3. Эти величины обозначают количество азота в белке, осаждаемом антигеном, в микрограммах в 1 мл сыворотки. Из полученных результатов следует, что изученные соединения, вводимые в виде маслообразной эмульсии, позволяют значительно, увеличить количество антител, образующихся в ответ йа введение антигена, а также вызывают появление заторможенной сверхчувствительности по отношению к тому же антигену, причем оба указанных воздействия по крайней мере равны, в отличие от эффектов, наблюдаемых при использовании в качестве добавки МДП. Исследование противоинфекционной активности по отношению к К 1 еЬз.е 11 а проводят по известной методике, К 1 еЬ- з.е 11 а рпеишопае, вводимая в дозе 1-2 10 внутримышечно мышам, вызывает смерть большей части, если не всех животных, в течение недели после введения. Спустя 8 дн, выживаемость животных значительно увеличивается. Проводят наблюдение за степенью выживаемости у групп мьппей, зараженных в приведенных условиях и обработанных описываемыми Н-ацетилмурамилпептидами. Для проведения опытов используются мыши гибридной породы (С 57 В 1)6 хАКК/Г 1. поставляемые институтом Пастера, где они получены от пооды, поставляемой С.Б.Й.Б. в Орлеане. Инфекционную культуру К 1 еЬв 1 е 11 а рпецшопае штамм капсуларного типа 2, биотипа й, получают из 16-часовой культуры в среде для получения пневмококков (В 53515, институт Пастера), Доза заражения 2 10 К 1 еЬзде 11 а, которая вводится внутримышечно. Исследуемые соединения132 Ь 197 2 Таблица 5 вводятся внутривенно в 0,2 мл эпирогенного Физиологического раствора, Контрольным животным вводится только физиологический раствор. Исследуемые соединения вводят животным через 24 ч после заражения. В результате проведенных исследований установлено, что соединения ЧТ и Х 1 проявляют противо- инфекционную активность, что следует из более высокого процента выживших 0 животных по сравнению с контрольной группой.Данные по противоинфекционной активности соединения 71 представлены в табл. 4, 5 Время инкубации,ч Контроль ЛПС 1 0 131 2 129 3 122 4 119 5 - 113 129 125 129 118 120 109 22 1 10 1 14 104 108 118 88 7,7 Таблица 4 ИнПроцент выживших животныхСоеди- Число некие мышей декс 3 день 5 день 10 день щиты, 7 25Способ получения И-ацетилмурамилпептидов общей формулы СН 2 ОН. НОНЬ спи р 1 Исследование влияния на коагуляцию30крови проводят по известной методике,Все количество крови, взятой дляопыта, делится на две части, однаиз которых центрифугируется для получения плазмы без тромбоцитов (ПБТ).1 мл крови инкубируется в пластмассовой капсуле в присутствии 100 мкгисследуемого соединения. Кроме того,приготавливают капсулы, содержащие0,1 мл ПБТ, к которым добавляют через 40каждый час в течение 5 ч по 0,1 млинкубационной смеси, после чего по0,1 мл 0,025 М раствора хлористогокальция. Измеряют время коагуляциии определяют активность изученныхсоединений по отношению к коагуляциив виде зависимости сокращения времени коагуляции по отношению к контрольному образцу, в котором используется физиологический раствор. Полученные результаты сравниваются с результатами, полученными с липополисахаридом (ЛПС) - веществом, значительно способствующим коагуляции,взятым в качестве эталонаОВС и 1 и Р СК НСОСНЗ СООТГ енил;ензил; де- водород, - М кондеисируют с дипептидом общеимулы Контроль 24 29 12,5 12,5 Ч 1 24 92 75 75 63 Полученные результаты представлены в табл, 5,Время коагуляции, с В результате проведенных исследований установлено, что предлагаемые соединения в отличие от ЛПС не ускоряют коагуляцию крови. Формула изобретения НО СН - сн ънсосн СОХ.-ЪН-СН - СООТГ 11СН 2 СН 2 С 01 Ч Н,где Х - Ь-аланил, Ь-серил, Е-валил; К - линейный или разветвленный 1 С -С -алкил 1 ь У отличающийся тем, что,защищенное производное мурамилавой кислоты общей формулы1326197 14 групп путем каталитического гидрирования в присутствии уксусной кислоты. где Х и В имеют указанные значения,с последующим отщеплением защитных Составитель О. Галкин Редактор И.Николайчук Техред В.Кадар Корректор Е. РошкоЗаказ 3130/59 Тираж 347 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и отхрытий113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграФическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4