Способ одновременного количественного определения витамина а и каротиноидов

(51)5 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИРИ ГКНТ СССР Е ИЗОБРЕТЕН ОПИС ВТОРСКОМУ С ЕЛЬСТВУ Изобретение относится к химическим определений, так как фосфорно-молибденометодам определения и может быть исполь- вая кислота дает цветную реакцию с бользовано при определении содержания вита-шим числом различных соединений, т.е, мина А и каротиноидов .в масляных является неспецифическим реагентом, что концентратах. витаминных премиксах, био- приводит к существенному завышению релогическом материале в химических, фарма- зультатов. Кроме того, серьезные затруднецевтических, .сельскохозяйственных и ния представляет сама фосфорно-молибпрочих биологических исследованиях, а так- деновая кислота. вследствие ее низкой стаже при контроле производства витамина А.: . бильности,Известен способ определения витами- Наиболее близким к предлагаемому по на А, включающий омыление материала технической сущности и достигаемому эффекспиртовым раствором щелочи, экстракцию . ТуявляетсяспособопределениявитаминаА неомыляемой фракции органическим рас- . икаротиноидов, включающийомылениематворителем и проведения цветной реакции териала спиртовым раствором щелочи в тес фосфорно-молибденовой кислотой, чение 90 мин, экстракцию неомыляемойНедостаткамиданногоспособаявляют- фракции бензолом, выдерживание экстрася низкая точность и высокая погрешность гирующей смеси в течение 15 мин для разде(21) 4716674/13(56) Авторское свидетельство СССР М 590664, кл. 0 01 Й 31/08, 1978.,3.Ч 1 ащпооцу,. 1961, 7., М 2, р 150 - 162. (54) СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА А И КАРОТИНОИДОВ(57) Изобретение относится к химическим методам определения и может быть испольовано при определении содержания витамина А и каротиноидов в масляных концентратах, витаминных премиксах, биологическом материале, в химических, фар-. мацевтических, сельскохозяйственных и прочих биологических исследованиях, а также при контроле производства витамина А. Целью изобретения является упрощение и сокращение длительности процесса. Способ включает щелочной гидролиз пробы, эк- стракцию определяемых веществ органическим растворителем, обработку. экстракта минеральной кислотой и спектрофотометрический анализ, при этом в качестве органического растворителя используют этилацетат, а из минеральных кислот используют тетрафторборную кислоту в коли. честве, обеспечивающем ее содержание в смеси с экстрактом 1,0 - 2,7, при этом обработку экстракта проводят в течение 2 - 5 мин. 1 ил 8 табл.ления водного и бензольнаго слоев, промывкуу бензольного слоя водой для удалениящелочи, разделение полученного экстрактавитамина А и каротинаидов на две равныечасти, В первой спектрофотометрически определяют каротиноиды, используя в качестве раствора сравнения чистый бензолдлина волны 460 нм). Во вторую часть экстракта добавляют 5 мл спиртового растворасоляной кислоты, встряхивают и помещаютв темное место, Через 15 мин кислоту нейтрализуют эквивалентным количеством щелочи, бензольный слой промывают водой ицентрифугируют для осветления. Полученный раствор спектрофотометрируют при390 нм; в качестве раствора сравнения используют раствор, в котором ранее определяли каротиноиды,Недостатки прототипа заключаются вследующем.Используемый экстрагент- бензол даетустойчивые эмульсии с водными растворами щелочей, которые дополнительно стабилизируются присутствием этанола иповерхностно-активных веществ, выделившихся в процессе амыления из анализируемых образцов. При отстаивании системыгидролизат - экстрагент даже спустя 30 мйнпосле зкстрагирования разделение фазпроисходит не полностью. При отделениибензольнога слоя от воднага часть бензолас растворенными веществами теряется вместе с водой.Аналогичный процесс, хотя и в меньшейстепени, наблюдается при отмывке бензольного экстракта водой для удаления примесей щелочи.Образование водно-бензольных эмульсий приводит к понижению точности анализа, занижению полученных результатов.Деление экстракта на две части вноситдополнительную операцию в ход анализа,еще больше понижает точность определений и увеличивает их продолжительность.Для перевода витамина А в аналитическую форму дегидровитамин А) часть бензольного экстракта заливают спиртовымраствором кислоты, спустя 15 мин смесьнейтрализуют и опять промывают. Переводвитамина А в дегидроформу проводится в. двухфазной системе бензол-вода что неэффективно (скорость дегидратации в гетерогенной среде ниже). Кроме того, в процессепромывки снова образуется эмульсия, приэтом теряется часть дегидроформы витамина А.После промывки раствор остается мутным. Для его осветления приходится использовать дополнительную операцию -центрифугирование, что удлиняет анализ.мулятивного действия 10 20 носительно чистого этилацетата, затем в . кювету микропипеткой добавляют 1,0-2,70 45 Этилацетатный экстракт промывают 23 раза дистиллированной водой, затем в мерную пробирку переносят полученный раствор и доводят этилацетатом объем до 15 мл, Удаление остатков воды проводят встря 25 30 35 40 В процессе анализа приходится рабо-.тать длительное время с бензолом-ядом куЦель изобретения - упрощение и сокращение длительности процесса.На чертеже представлен график, поясняющий способ.Согласно предлагаемому способу биологический материал заливают 2 н. водноэтанольным раствором щелочи, добавляют в качестве антиоксиданта аскорбиновую кислоту и омыляют в течение 60-90 мин при 60 С; из полученного гидролизата этилацетатом извлекают витамин А и.каротиноиды. Экстракт 2 - 3 раза промывают водой да удаления следов щелочи, переньсят в мерную пробирку или колбу, доводят его объем до заданной величины. Аликвоту 3 мл спектрофотаметрируют на длине волны 450 нм атобъем) тетрафтарбарной кислоты, полученную смесь встряхивают и через 2-5 мин снова спектрофотаметрируют при 390 нм. По оптической плотности экстракта при 450 нм определяют содержание каротиноидов в биологическом материале, при 390 нм - количество витамина А по приросту оптической плотности.При использовании предлагаемого способа точность определения каротиноидов в 1,4 раза, а витамина А в 2,1 раза выше, чем способа-прототипа. Время, затрачиваемое на анализ согласно предлагаемому способу, меньше в 1,8 раза.П р и м е р 1 Определение витамина А и каротиноидов в печени кур.Навеску гамагенизираванной куриной печени (0,5 г) заливают 5 мл 2 н. водно-этанольнога раствора гидроокиси натрия, добавляют 0,05 г аскорбиновой кислоты и нагреваютпри 60 ОС в течение 90 мин. Затем к гидролизату добавляют 15 мл этилацетата и харашо встряхивают. хива нием экстракта с 3 - 5 г безводного сульфата натрия,После осушивания 3 мл экстракта фотометрируют на длине волны 450 нм для определения концентрации каротиноидов, В качестве раствора сравнения используют чистый этилацетат. Для определения концентрации витамина этот же экстракт фотометрируют на длине волны 390 нм и, таким образом, получают начальную оптическую плотность экстракта, Затем в обе кюветымикропипеткой добавляют 0,05 мл тетраф- Способ осуществляют так же, как в приторборной кислоты и отмечают приростоп- мере 3, лишь уменьшив навеску до 50 -тической плотности - ЬА, Через 2 - 4 мин, 100 мг.когда оптическая плотность экстракта пере- П р и м е р 5. Определение витамина Астает расти, записывают. ее максимальное 5 и каротиноидов в плазме крови..значение, Измерения проводят также на Плазму крови (5-6 мл) помещают в кругдлине волны 390 нм. По разнице между вто- лодонную колбу, щелочной гидролиз и всерым и первым измерениями рассчитывают другие операции проводят согласно примеприрост оптической плотности, ру 1С помощью пересчетной формулы (или 10 Определение витамина А.и каротиноик алибровочного графика) по величине А доввлюбыхдругихсубстратах проводяттак450находят содержание каротиноидов, по А - же, как описано в примере 1.количество витамина А в исследуемом об- П р и м е р 6. Определение зависимостиразце, Содержание витамина А рассчитыва- скорости дегидрирования витамина А от ко 15 личества тетрэфторборной кислоты в этилаХд =Кд( А 90 - А 90)цетате.9 К 3 мл этилацетатного экстракта витагде Хд - количество витамина А в пробе, мина А (концентрация витамина Амкг/г; 66,3 мкгlмл) добавляют 0,03 - 0,50 мл тетЧ - объем этилацетата, мл; 20 рафторборной кислоты. Первое измерение9 - навеска образца, г; оптической плотности на длине волны 390Кд - калибровочный коэффициент (тан- нм проводят через 60 с после смешиваниягенс угла наклона калибровочной прямой), растворов, все последующие изменения - синтервалом 30 с, При этом в зависимости от390А 1 - оптическая плотность раствора 25 дозы внесенной НВГ 4 за строго определенпри 390 нм до добавления тетрафторборной ное вРемя в каждом случае витамин А полКИСЛОТЫ, ностью переходит в дегидроформу, при390 этом оптическая плотность достигает мэкА - оптическая плотность растворасимального значения и в течение длительного времени не изменяется.после до авлениЯ тетРафтоРбоРной кисло о вты при 390 нм, Результаты приведены в табл, 4.Данные анализа печени кур приведеныв табл, 1.Из данных табл. 4 следует, что наиболееи каротиноидов в желтке куриных яиц. Сравдом в течение 2 - 5 мин наблюдается и инительные испытания предлагаемого спо- тами35 добавлении к этилацетатном аство виц ур с вору висоба и протот 14 па.таминэ А тетрафторборной кислоты в количестве 1,0 - 2,7 об. , т.е. когда соотношениеНавеску 1 г яичного желтка анализируют по способу-прототипу и предлагаемому 38 1 П и влэтилацетат: НВР 4 лежит в и е елах 100;1 способу, кэк описано в и им 1 р 38 1 При добавлении тетрафторборной кистэты испытаний приведены в табл, 2 и 3, естве менее 1,0 Д скоростьПРоведенные испытания Показали, что . др ф Р витамина Ад ны тэ " и . образования дегидрофо мы витамина Аиспользование предлагаемого способа позволяет повысить точность определения ка- . анап зиротиноидов в 1,4 раза, витамина А - в 21 анализируемом растворе создаются услораза по сравнению с прототипом, Вр 45 вия протекания побочной реакции. Призатрачиваемое на анализ согласно предла- этомдегидроформа либо образуется не полгаемому способу, меньше в 1,8 ра а ностью, либо не образуется вообще.П Р и м е р 3, Определение витамина А Рэфически пРоцесс дегидратации вии каротиноидов в комбикорме,тамина А тетрафторборной кислотой предНавеску комбикорма 2 - 3 г помещают вкруглодонную колбочку добавляют 5 мл 2 н часть спектРа витамина еще до добавлениЯводно-этанольного раствора ги тетрафторборной кислоты, т,е, чистого витатрия, 0,05 г аскорбиновой кислоты и нэг - . (кривая ) в о ласти 340-450 нм ивают при 60 С в течение 90 частьспектрэдегидроформывитэминаАпоДальнейшие опе а ". 55 сле добавления тетрафторборной кислотыперации проводят согласнопримеру 1,через каждые 30 с. измерения (кривые 2 - 6).П р и м е Р 4, Определение ви Доза НВР 4 0,05 мл, Как видно из чертежа,и каротиноидов в премиксе, полное дегидриРование витамина А наступает уже через 2 мин, что также подтверждает дан н ые табл. 4.П р и м е р 7, Определение зависимостивремени полного дегидрирования витаминаА от его содержания в растворе.К одинаковым обьемам раствора витамина А (3 мл) с различной его концентрацией добавляют одно и то же количествотетрафторборной кислоты - 0,05 мл. Приэтом скорость реакции дегидрирования,время выхода и процент выхода аналитической формы витамина А остаются неизменными,Результаты измерений приведены .втабл. 5.Из данных табл. 5 следует, что изменение концентрации витамина А не оказываетвлияния на скорость и полноту дегидратации, т.е. предлагаемый способ применимдля большого интервала концентраций витамина А.П р и м е р 8, Определение устойчивостидегидроформы витамина А.К 3 мл раствора витамина А добавляют0,05 мл тетрафторборной кислоты. Определение оптической плотности раствора проводят каждые 30 - 60 с,Результаты измерений представлены втабл, 6.Максимальное количество дегидроформы в данном случае образуется через 3 мин,Измерения показывают, что полученная дегидроформа витамина А устойчива во времени и не разлагается при проведениианализа в течение 10-20 мин.П р и м е р 9, Построение калибровочныхграфиков для определения витамина А икаротиноидов,Масляный препарат витамина А разбавляют гексаном в 250, 1000 и 2500 раз. Аликвоты растворов 1 - 3 мл заливают 5 мл 2 н.водно-этанольного раствора гидроокйси натрия; омыление и все дальнейшие операциипроводят, как описано в примере 1.Результаты испытаний приведены втабл. 7,Через полученные точки проводят калибровочную прямую. Калибровочный коэффициент (тангенс угла наклона прямой)Кд равен 6,097.Калибровочный график для определения каротиноидов строят с помощью растворов бихромата калия. Калибровочный коэффициент Кк равен 4,46.П р и м е р 10. Сравнение продолжительности анализа согласно предлагаемому и5 известному способам,Сравнение предлагаемого способа ипрототипа указывает на то, что время, затрачиваемое на анализ образца по способу стетрафторборной кислотой, значительно10 меньше, чем по прототипу; способ упрощается за счет устранения ряда операций входе анализа,Результаты сравнения приведены втабл. 8.15 Таким образом, использование в качестве экстрагента этилацетата исключает образование в процессе экстракции эмульсии. и способствует более быстрому разделениюфаз, что повышает точность определений и20 сокращает продолжительность анализа; использование для дегидратации витамина Атетрафторборной кислоты позволяет упростить способ и сократить время его выполнения за счет устранения ряда аналити 25 ческих операций; замена бензола нетоксичным этилацетатом улучшает условия работы, расширяет возможности использованияспособа.Проведенные испытания показали, что30 при использовании предлагаемого способаточность определений каротиноидов повышается в 1,4 раза, витамина А - в 2,1 раза.Время анализа сокращается при этом в 1,8раза.35 Формула изобретенияСпособ одновременного количественного определения витамина А и каротиноидов, включающий щелочной гидролизи робы, экстра кцию оп ределяемых веществ.40 органическим растворителем, обработкуэкстракта минеральной кислотой и спектрофотометрический анализ, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения и ускоренияпроцесса, в качестве органического раство 45 рителя используют этилацетат, а из минеральных кислот используют тетрафторборную кислоту в количестве, обеспечивающемее содержание в смеси с экстрактом 1,02,7, при этом обработку экстракта прово 50 дят в течение 2 - 5 мин.1723518 Таблица 1 Концентрация витаминаА, мкг/г Оптическая плотность при 390 нм Навеска,г Оптическаяплотностьпри 450 нм,А 450 Образец 1 2 3 4 328,9+2,64 Таблица 2 Концентрация витанина А, мкг/г желтка Выход внутреннегостандарта, Ф Образец Объенрастворазтмлацеата, мл Навеска,г Оптическая плотность 1Концентрациякаротиноидов,мкг/г желтка Аяю Ате дзо Кароти-Витамин ноидыЯ 0,143 0,093 0,135 0,088 0,130 0,084 0,130 0,037 0,114 0,026 0,119 0,035 Контроль 0,531 16,0 0481 15,05,795,804,585,392 0,95 19,22 18,78 20,10 19,37 ф 0,91. 0,460 15,0 0,486 15,0 0,498 16,0 Контроль + внутренний стандарти о, 165 о 07 0,841 0,734 О 69 0 1 О О 851 О 741 0,188 о,2 0,875 О,У 53 24 аоо 23,26 26,94 150,73 142,25 149,88 147,628 Э,Э 2 101,1 94,8 24,73 1 2,64 к В качестве внутреннего стандарта в каждую пробу добавляли 5,30 мкг каротиноидов и 150 мкг витамина А в расчете на 1 г навески. б л и В 0 тностьКонцентрация - каротинондов, мкг/г брав Навескаг Концентрациявитамина А,Оптическая пло утреннегоа, Ф Объем бензоламл Выходстан А аротино- иды ами 15,0 15,О 15,0 0,492 0496 0,510,187 О,УЭ 5 ,205 0,931 ,150 0,604 0,512 0,520 0,480 Контроль + внутренний стандарт е 129,2 161,1 113,2 15,0 15,0 5,0 134,53 ьээ 13 97,6 86,90+3,ждую пробу добавляли 5,30 икг каротиноидов и 50 мкг витамина А качестве внутреннего стандартаасчете на 1 г навески,0,073 0,067 0,070 0,143 0,005 0,004 0,004 0,009 0,003 0,003 0,003 0,006 0,265 0,246 0,255 0,516 Концентрация каротиноидов,мкг/г 0,262 4,58 0,243 4,00 0,252 3,82 0,510 4,21а4,15+0,37 328,4 331,7 329,4 326,11723518 Таблица 4 Объем раствора НВР 4,мл Соотношениеобъемов растворов витамиа А и НВР 4 КоличествоНВР 4 тоб,4 Выход дегидроФормы, 3 Объемраствора, мл Таблица 5 Время полного Выход дегиддегидрирования роФормы, 3витамина А,мин Объем добавляемого раствора НВР,мл Концентрация. витамина А, мкг/мл 0,05 0,05 0,05 3,00 3,00 3,00 20,2 46,5 80,5 100 100 100 Таблица б 3 3,5 и 5 10 20 30 Время иэмерения,мин 1,5 2 Оптическая плотность Формы 0,93 1,0 1,05 1,05 1,05 1,05 1,05 1,03 0,9 0,96 Выход дегидроФормы 88,6 952 100,0 100,0 100,0 100,. 100 98,1 93,5 91,5 Таблица У 2,29 ,59 9,1 У 18,35 Концентрация растворов витамина А,мкг/мл 0,92 г,5 0,35 о о,365 о,ууо. 1,5 бо 2,950 Прирост оптической плотности, д это о,обб 3 3 3 3 3 3 3 0,01 0,02 0,03 0,05 0,08 0,09 0,10 0,15 300;1 150:1 100:1 60;1 38;1 33:1 30; 1 20:1 0,33 0,67 1,00 1,67 2,67 3,00 3,33 5,00 Время полного дегидрирования витамина А,мин 7,0-9,5 5,5-8,О 4,0-5,0 3,0-4,5 2,0-4,0 1,5-3,0 1,0-2,0 0,5"1,5 100 100 100 100 100 95,6 91,0 85,814 1723518 13 Таблица .8 Операция 60-90 60-90 Омыление Экстракция витамина Аи каротиноидов 7-.15 3-.5 Промывка экстракта водой 5-10 15-30 Разделение экстракта Перевод витамина в дегидроформу 3"5 Нейтрализация растворащелочью и промывка Центрифугирование Спектрофотометрическоеизмерение Полное время анализа Составитель П.СурайРедактор Л.Веселовская Техред М.Моргентал . Корр.Малец Тираж Подписноевенного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Гагарина, 101 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгор Заказ 1062 ВНИИПИ Госуд Продолжительность,мин, по способуг прототипу предлагае- мому 5 5