Способ получения антибиотика м 139603

СОКИ СОВЕТСНИХкаелвмвюРЕСПУБЛИК И 91 (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ПАТ 15 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ бССРГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Империал Кемикал Индастриз Лимитед (СВ)(72) Дэвид Хью Дэвис, Джоффри Лайтфут Флайд НоррисСВ.1(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА М 139603 путем культивирования штамма ЯСгергошусев 1 оп 81 врогой 1 ащв В С 1 В 1 1426 в водной питательной среде, содержащей источник ассимилируемого углерода в условиях аэробо ного встряхивания при 25-30 С, экстрагирования продукта нз смеси ферментации этилацетатом, последующей очистки и выделения целевого продукта в форме свободной кислоты или ее металлической соли.Изобретение относится к способуполучения нового кормового антибиотика М 139603, повышающего количество протионовой кислоты в желудочномсоке рубца за счет снижения долиметана и или уксусной кислоты).обладающего антимикробиой активностьюотносительно грамположительных микроорганизмов и возбудителя кокцидиоза, Антибиотик М 139603 можетбыть использован в качестве стимулятора роста жвачных животных, атакже домапней птицы и свиней.Способ получения антибиотикаМ 139603 в литературе не описан.Антибиотик М 139603 получают;, путем культивирования штамма Зггер-.Соаусез 1 оп 8 гзрогой 1 ачпз КС 1 В 11426в,водной питательной среде, содержащей источник ассимилируемого углерода в условиях аэробного встряхиоваиия при 25;30 С, экстрагирования,продукта из смеси для ферментацииэтилацетатом, последующей очисткии выделения целевого продукта вформе свободной кислоты или ее металлической соли,Штамм Згг. 1 опдврогой 1 ачцвБС 1 В 11426 хранится в Государственной коллекции промышленных бактерийминистерство сельского хозяйства,рыбной и пищевой промышленности,Торри Ризерг Стэйшн, 135 Эбби Роуд,Абердин АВ 98 Р, Шотландия, а такжев Сепггаа 1 Ьогеаичоог ЗсЬпщае 1 сц 1 ги.гез РО ВОф 273, Оовгегвггааг 1, 3740АС ВААгп, Нидерланды, под номеромСВ 8 312,79,Штамм Згг. 1 оп 81 врогой 1 ачцз 01 СВ11426 культивируется на средах, полученных в соответствии с рекомендациями для Международного проектапо Зйгергошусев (ИСП)" при 25 С насвету,ИСП 1. Дрожжи Триптон (но с агаром).5 дней - тонкий, слева влажный,бархатистый, желтовато-коричневый;обратная сторона неокрашенная.13 дней - тонкий, бархатистый,слегка гранулированный, светло-коричневый; обратная сторона неокрашенная.ИСП 2. Дрожжевой экстракт (агаровый солодовый экстракт) .5 дней - тонкий, бархатистый,светло-серый; обратная сторонаочень бледная желтовато-коричневая.ИСП 8Углеродпоглощающийагар15 дней - углерода нет - очень редкий, погруженныйГлюкоза - тонкий (плотный) бархатистый, светловато- коричневыйАрабииоза - редкий Фруктоза -тонкий; бархатистый, светловато-коричневыйИноэитол - очень редкий Оценка 50 55 13 дней - значительный, рельефный,бархатистый, светло-желтый (коричневый), серый; обратная сторонакоричневатая.5 ИСП 3. Агар овсяной муки.5 дней - редкий до тонкого, бархатистый, светло-желтый (серый);обратная сторона не видна.13 дней - тонкий, слегка рельеф 10 ный, бархатистый, светло-серый;обратная сторона не видна.ИСП 4. Неорганические соли -исходный агар.5 дней - тонкий, светло-.коричне 15 вый, слегка гранулированный; обратная.сторона неокрашена.13 дней - тонкий, слегка влажныйкоричневый; обратная сторона болееили менее бесцветна.20 ИСП 5. Глицерин - аспарагиновыйагар,5 дней - тонкий, слегка гранулированный, светло-коричневый; обратная сторона неокрашена.25 13 дней - тонкий, бархатистый,светло-серый; обратная сторона неокрашена.ИСП 7. Тирозиновый агар,5 дней - редкий до тонкого, слег=.30 ка гранулированный, бархатистый,светловато-коричневый серый); обратная сторона не окрашена.13 дней - тонкий, бархатистый,слегка рельефный, светловато-корич-.невый; обратная сторона светловатокоричневая (серая).При старении ИСП 7 культура становится обычно более розовато-корич -.:невой, но имеет области с более40 густой окраской, что связано с более интенсивной споруляцией.121 Маннитол - тонкий,бархатистыйРаффиноза - оченьредкийРамноза - редкийКсилоза - редкий2328 а при 120 С в течение 20 мин, Инокули. рованные колбы встряхивали при 25 Со в течение 120 ч на ротационном шэйкере, а затем содержимое колб объ-.единили и рН довели до 3, осторожно добавляя 0,1 н. соляную кислоту.0,250,5 0,1 0,5 Общие черты.Не образуются меланины, обратныепигменты, а также растворимые пигменты.Споры зарождаются в открытыхи плотных спиралях, часто отделенных от основных осей, более прямойнесущей гифой или цепочкой спор,Сами по себе споры трудно .увидетьв обычный микроскоп, так как оннрасположены очень близко друг к .другу. Споровые стенки (Е.М. на4% ураннл ацетатном составе) гладкиеП р и м е р 1Бггергошусев 1 оп 8 дврогоГ 1 ачцв штамм НСВ 1426вырастили в 500-мнллилитровой .колбе Эрленмейера на триптон-дрожжевом агаре, содержащем: Триптон("Оксоид" , 42) 0,5% в/о; Дрожжевойэкстракт ("Оксоид".1, 21) 0,3% в/о,которую предварительно простерилнзо вали в автоклаве в течение 20 мннпри нормальном давлении, рН средыпримерно 7,0. Колбу встряхивалипри 25 С в течение 120 ч на ротационном шэйкере.Затем содержимое колбы использовали для инокуляции еще 10 анапогичных колб, каждая из которыхсодержала 200 мл следующей питательной среды, % в/о:Сиропглюкозы 3,0КарбонаткальцияХлорид натрияСульфат магния,гептагидрат 0,05КонцентратмикроэлементовБактериологическийпелтон"Лаб Лемко"Деионизированнаявода До 100рН довели до 7,2 и среду предварительно стерилизовали в автоклаве О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Среду проэкстрагировали этилацетатом (2 600 мл), экстракты объединилии осушили над сульфатом натрия, растворитель упарили и получили маслянистый остаток (290 мг),Этилацетатный экстракт очистилис помощью препаративной прослойкойхроматографии на двух пластинах= 0,39 (приблизительно) сняли с пластины и проэкстрагировали этилацетатом, растворитель упарили и получили вязкую смолу (21 мг), котораяв опытах .и чэ.гго проявила,антибактериальное действие против З.ацгецз.Активную фракцию далее очислили спомощью препаративной послойнойхроматографии на пластине с силикагелем ("Кейселгел" 60 Е, 2020 смтолщина 0,25 мм), используя смесьдиэтнлового эфира, метанола н муравьиной кислоты в отношении 95:4:1 (пообъему) соответственно. Полосу при= 0,66 (приблизительно) снялис пластины и проэкстрагировалнэтилацетатом, в результате чегопосле упаривания растворителя полу-чили вязкую смолу (9 мг) . Смолупревратили в натриевую соль встря.хивая хлороформенный раствор сраствором гидроксида натрия (0,1 М ),Хлороформенный слой отделили и высушили над сульфатом натрия, растворитель выпарили и получили М 139603в виде белого твердого остатка(8 мг), Т.пл.29-132 фС,ИК-спектрпоказал следующие полосы поглощения:3300, 1725, 1645, 1565 и 915 смНайдено, %: С 67,5; Н 8,8.СэНээ ОвПаВычислено, % С 67,3; Н 8,5.Масс-спектр: М = 624,361, расчитанный для Сз НОзВа = 624,364,ээ уэ еК = 0,39, тонкослойная хроматограФия на Мерк 60 Г, 0,25 мм, пластины, проявитель этилацетат, наблюдается в виде коричневого пятна пос-.ле опрыскивания Зн. серной кислотойои нагревания при 100 С.П р и м е р 2. БГгерГошусез 1 опуврогой 1 ачцз БС 1 В 11426 выращиваликак культуру на скошенном агаре ИСП(45 мл), в течение 7 дней при 30 фС;, Три таких посева по отдельнос ти собраны в три колбы с 100 мл стерильной воды, и полученные таким образом суспензии использованы для инокуляции трех 2-литровых колб, каждая из которыах содержала 1 л среды следующего состава, У, в/о:Глицерин 3,0Бактериологическийпепуон ("Оксощ"1,37) 2,0КНРО 4 . 0,024Мв 804КонцентратмикроэлементовМелДеионизированнаявода ль которую предварительно стерилизовали в автоклаве при нормальном давлении в течение 1/2 ч, рН приблизительно 6,7.Подготовленные таким образом три 2-литровые колбы встряхивали в те- чение 3 дней при 30 С на ротационном шэйкере. Затеи содержимое трех колб объединили и использовали для инокулирования ферментера из нержавеющей стали, содержащего 30 л стерилизованной среды следующего состава, Х в/о:ГлицеринСоевая мука В Р 70 1,0Мел 0,25Перелоза З,ОХлористыйнатрий 0,5МАЗО 7 Н О 0,05Концентратмикроэлементов0,1 Дистиллированнаявода До ЗО л 0,1 0,Содержимое Ферментера перемещали в течение 70,ч прй 30 С, используя для этих целей мешалку с 4 плосФ кими лопастямн, вращающуюся со скоростью 350 об/мин,и аэрацию со скоростью 15 л/мин. Перед загрузкой автоклава в смесь добавили силиконовый пеногаснтель 30 мл ("Силкон-. лапс" , рН культуры 7,9, образующу юся ферментационную смесь (22 л) смешали с равным объемом этилацетата Через ЗО мин смесь центрифугировалй и этилацетатный экстракт (приблизительно 18 л) осушили над безводнымсульфатом натрия и профильтровали.Фильтрат упарили при пониженном 5 давлении и получили маслянистый остаток (,10,7 г) .М 139603 получили из описанногоконцентрата следующим образом.Маслянистый остаток (0,7 г) раст ворили в минимальном объеме этнлацетата и приготовленный раствор поместили в верхнюю часть колонки с нейт 4ральной двуокисью алюминия (ВоелмИ, 200 г 18 см 4 см), приготовленный 5 в виде суспензии в этилацетате. Сначала колонку элюировали этилацетатом,затеи 50 Х в/о смесьЬ этилацетат иметанола и окончательно метанолом.После выхода из колонки фронта раст ворителя были собраны следующие фракцннеФракцияОбъем, мл Элюент,Ж в/о25Этилацетатааа11501505015011150МетанолЦ иН150. 50яаМетанол2002001045200Как показали результаты тонкослой.ной хроматографии на силикагеле при проявлении 203 в/о раствором ацетона 50 в петролейном эфирет .Лип . 60-80 С),ффракции 7-11 включительно содержат М 139603 (К- 0,22), Поэтому их объединили и выпарили, в результате чего получили вязкую смолу (840 мг) 55 которую дополнительно очистили с помощью препаративной послойной хроматографии на силнкагеле 1,"Кейселгель 601. 250" Ф.Мерк, 40 см в320 см, толщина 2 мм), используя вкачестве элюента.смесь 207. в/о ацетона в петролейиом эфире (т.кип.60.80 ОС). Уф-видимую полосу приВ с 0,22 (приблизительно) выделилииз двух пластин,и проэкстрагировалиэтилацетатом, экстракт вьпарилидосуха и получили вязкую смолу(240 мг), которая закристаллизовалась при добавлении петролейногоэфира ( т.кип, 60-80 С).Этотматериалперекристаллизовалн из петролейногоэфира (т.кип,60-80 С) и получилиМ 139603 в виде бесцветных кристаллов, которые отфильтровали и высушили (2 О мг), т.пл. 176-178 СУф-спектр в эталоне имел полосыпоглощения при 234 нм ( Е = 12900)и 272 нм ( Е = 10800). ИК-и ЯМРспектры аналогичны полученным дляпродукта примера 1.П р.и м е р 3. М 139 ЬОЗ (40 мг)растворили в смеси ацетона (1 О мл)и воды ( мл ), добавили 1 мл 2 н.соляной кислоты и смесь интенсивно.сперемешивали в течение 5 мин. Добавили дистиллированную воду (20 мл),смесь проэкстрагировали дихлорметаном (210 мл). Органический слойотделили и промыли 2 н. соляной кислотой, а затем дистиллированнойводой. После этого дихлорметановыйслой ун и получили вязкуюсмолу (33 мг) свободной кислоты,соответствующей И 139603.Найдено, Х: С = 69,5; Н = 9,1СИНИ 08Вычислено, 7: С = 69,8; Н = 9,0.ИК-спектр, снятый на таблетке изКВ, имеет характеристические полосы поглощения прн 3500,1765,650,1575 смП. р и м е р 4. Свободную кисло.ту, соответствующую.И 139603 (30 мг).растворили в смеси тетрагидрофурана(7 мл) и воды (1 мл) . К воднойтетрагидрофурановой смеси добавилигидроксид щелочного металла, ХОГ( 2 Н, 2 мл) и смесь затем интенсивноперемешивали в течение 10 мин.Добавили воду (10 мл), и растворпроэкстрагировали серным эфиром(215 мл). ЭРирные экстракты объединили и выпарили, в результате чегополучили соли щелочных металлов,соответствующие натриевой соли,М 139603.Когда Х - калий, то образуетсякалиевая соль, т.пл. 146-150 Сь, 20 . сокращения доли ацетата (Ас/Р)в летуСобрали желудочный сок рубца отдвух бычков-катратов, которых кормили одинаковым кормом, состоявшим изсена и концентратов. Время взятияппоб по воэможности максимальностандартизировали, желудочный сокдвух животных собирали в соотношении 50/50. Болыпие твердые включения отфильтровывали через четырехслойную муслиновую ткань. Затемфильтрат разбавляли в соотношенииодин объем фильтрата к трем объе мам искусственного желудочного сокарубца (приготовленного по методикеГ.Л.Бейлза), но без использования. уксусной кислоты. рН смеси довелидо Ь,9-7,0 с помощью насыщенного 40 45 50 55 5 10 15 молекулярная формула С, Н 0 К, как показано масс-спектрометрией, коточ рая дает молекулярный ион И массои 640, 335, рассчитано для С 1 НОВК = = .640,338.Найдено, /: С = 65,7 Х; Н = 8,57.С 4 Н 08 КВычислено, С = 65,6, Н = 8,3Когда Х - рубидий, то образуется рубидиевая соль, Т.пл. 95-120 С, молекулярной формулы С .Н .О, КЬ установленной масс-спектрометрией, которая дает молекулярный ион И массой 686,279, рассчитанный для СН О 686,286.П р и м е р 5. Способность М 139603 ингибировать образование метана в рубце жвачных животных и увеличивать количество протионата за счет чих жирных кислотах (ЛЖК ), проиллюстрирована следующим образом. водного раствора карбоната натрия. Аликвотные количества (50 мл) этой смеси распределили в 100 мл конические колбы, содержащие высушенное измельченное сено (0,5 г), и каждую колбу использовали для оценки испытуемого соединения при данной концентрации.Испытуемое соединение вводили в коническую колбу в виде спиртового раствора (этанольного), колбу продувалн углекислым газом, закрывалипробкой (резиновой) и термостатировали при 39 ОС.в течение 15-16 ч.Через 1 ч узкую полую иглу вставляли через резиновую пробку для снятия давления газа и иглу вынимализа 30 мин до конца термостатирования. Затем процесс ферментации оста1212328 О навливали, помещая колбу на лед, и после 15-минутного охлаждения анализировали газ, находящийся над жидкостью, на содержание в нем метана с помощьй газовой хроматографии. Затем содержимое колб фильтровав. ли через предварительно высушенный стеклянный фальтр. Три образца фильтрата анализировалн методом газовой хроматографии на содержание ЛЖК и, сравнивая это количество с предварительно определенным количеством ЛЖК до термостатирования, определяли точное количество ЛЖК (ацетата и пропионата), образующихся в процессе термостатирования.е результатах от конт- нных в отсутБыли получены следующн ты, выраженные. в нроцен рольных величин получеТ а Соедине- Концентние рация,иг на млконтТаблица 2 20проио" Испытуемыеруб группыо ствие исследуеиых соединенийтабл.1). Момензин, известныйтор роста, влияеций на функциюца, включен в виде контрольносоединения. олярный 7. от,общегооличества ЛЖК тат Пропиона б 25 ц а Ацетат/ пропионат, Ж относи" тельно конт- рольного Метан, 7 относи- тельно Отрицательна контрольная 9,8 9 оложит ель н онтрольныемонензин рольного.987 О,р 6. Способност еличивать долю про ращения доли ацета соке рубца овец пр следующим образом. три овцы содержал динаковои рационе,кг брикетов сена тного в день, Брик лам и давали дважды произвольно раздепилнатав от оса ты ПримМ 139603 уза счет сожелудочномстрнровалиДвадцатдельно натоящем изодного живделилй поподень. Овец на 3 отрицательных контрольных н5 положительных контрольных, которьвдавали моненэин, известный регулятор рубца, а 5 животньж давали 5 определенную дозу М 139 ЬОЗ. Подопытиьв животным давали момензин илиМ 139603 орально в количестве0,5 мг/кг в течение четырех днейподряд, и пробы желудочного сока О рубца собирали с помощью желудочногозонда через 6 ч после введенияисследуемых соединениЯ на четвертыйдень. Затем образцы желудочногосока рубца анализировали на содер жанне в нем ацетата и пропионата,как,описано в примере 2, Были. получены следующие результаты (см.табл.2). рой вводили монензин, Увеличениедоли пропионата в случае использования М 139603 значительно при ф 5 р 4 0,001 по сравнению с положительной контрольной группой, которойвводили монензин.П р им е р 7. АнтибиотикМ 139603 обладает также,антнкокци диоэньвк действиеи. Это показанопробойтканевой культуры в клеткахпочек цыплят, зараженных спорозои"тами Еьаег.а йепе 11 а. В этом опытеМ )39603 предотвращает рост споро зонтов при концентрации 0,001 частина миллион и обладает токсичным действием на клетки хозяина только приконцентрации 0,33 части на миллион.СоставительТехред М. Герг ель Редактор М, Недолуженко Корректор М.Самборская Заказ 653/62,Тираж 490 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д,4/5 Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 11 1212328 12Соединение М 139603 также облада- Согупебасйегицп аспе при концентрает грамположителЬным антибактериаль- ции ;й О мг на мл и поэтому может ным действием и предотвращает рост быть использовано как промотор роста ЗСарЬУ 11 ососсиз апгеив, Яйгерйососсцв нежвачных животных, например домашГаеса 1 дз, С 1 овйгЫыш че 1 сМд, 5 ней птицы и .свиней.