Способ получения антибиотиков

Союз Советских Социалистических Республик.03. 74 Государственный иомитеСовета Министров СССРпо делам изобретенийи открытий(45) Дата опубликования описания 14.06.77 Иностранцы Ъкон Дик Худ и (Великобритания) нис Батте Иностранная фирма(54 СПОСО УЧЕН 1 И АНТИБИОТИКОВ Изобретение относится к. микробиологии,а именно к получению антибиотиков.Способ получения антибиотика ММ 13902,или его солей заключается в том, что штаммйертотусев о 1 часецв АТСС 31126выращивают в аэробных условиях на среде,содержащей источники угйерода азота, минеральные соли и пеногаситель, с последующим выделением антибиотического комплекса и разделением его на компоненты извест ными приемами.Штамм, используемый для пол нтибиотика, был получен путемобработки Ь. рбчасеоб АТССнится в Американской коллекцномером АТСС 31126,Культурально-морфологические признаки,учения а мутат енной21379 и храи и культур под 15 пи зре х спор обычнодержит свышер гладкая.Э 3 Р4-воричпевый субсткоричневый, раует. Спорофорь ывают но ными, цепь соверхность споНа сределий серый/колий оливковомент отсутств и и мнцмицездушны ратный створиг.длиннь и пиг 2) Авторы изобретения Мартин На среде 3 5 Р2 - воздушный мицелий серый/коричневый субстратный мицелий оливково-коричневый. Растворимый пигмент отсутствует . Спорофоры длинные,На среде Д б Р5 - воздушный мицелий серый, субстратный мицелий коричневый, растворимый пигмент отсутствует. Спорофоры длинные.На среде 38 Р3 - воздушный мице лий серый, субстратный мицелий оливково- коричневый, спорофоры длинные. Растворимый пигмент отсутствует.Штамм усваивает рамнозу, инозит, глю козу, ксилозу, фруктозу, маннит, арабинозу; не усваивает раффинозу, сахарозу.Культивирование Й, оРчасецВ осуществляют при температуре 28+2 оС в аэробных условиях как на твердой или полужидкой питательной среде, так и в водной питательной среде, в которой растворены или суспендированы питательные вещества. Наиболее приемлемой является среда, содержащая сложные питательные вещества, такие как экстракт дрожжей, муку из соевых бобов и т.д, Прибавление ионов кобальта,528038 3ионов сулнрата и карбоната кальция оказывает благоприятное влияние,В процессе ферментации и выделенияантибиотика проводят биологические анализь 1 с применением штамма КРеЬсеИа - 5аеюфепеЗ 1(проба КАЯ).Целевой продукт получают иэ фильтратакультуры, Все этапы выделения и очисткиантибиотика должны протекать при температуре не выше 12 С, оДля разделения антибиотического комплекса можно применять различные известныеспособы. Наиболее целесообразной последом.тельностью стадий является адсорбция наугле, экстракция с переносчиком, хроматография на целлюлозе.П р и м е р 1, Получение ММ 4550(комплекс).81 ер 1 оиусеВ оЬчасеи АТСС 31126выращивают в течение 7 суток при темпера-Ь)отуре 28 С в колбе Ру на поверхности твердрй агар-агаровой среды следующего состава (в г/л);Дрожжевой экстракт 10,0Моногидрат глюкозы 10,0 ИАгар-агар 15,0Вода водопроводная, л До 1рН среды до стерилизации 6,8.50 мл стерильной деионизиромнной воды, содержащей 0,02% "Твин 80 ф, прили- Ювают к культуре в колбе Ру, и споры суспендируют встряхиванием. Полученную суспензию микроорганизмов прибавляют для вызревания к 75 л стерилизованной среды в бро-,дильном чане емкостью 100 л. 8 ЬСостав ферментационной среды (в г/л):Мука нз соевых бобов 10,0Моногидрат глюкозы 20,0Водопроводная вода, л До 14 ОДля предотвращения вспенивания в ферментационную среду до стерилизации добавляют 50 мл 10%-ного Плуроннка Ь.61 ф всоевом масле.Среду стерилизуют водяным паром и бродильном чаев в течение 20 мин при температуре 120 С. Культуральную жидкостьперемешивают со скоростью 340 об/Мин искоростью аэрации 150 л/мин, Инкубирование осуществляют при температуре 28 оС в )течение 45 час.7,5 л полученной культуры вносят в150 л стерильной среды в бродильном чане емкостью 300 л.Состав ферментационной среды (в г/л); ббСоевая мука 10,0Моногидрат глюкозы 20,0Мел 0,2Хлористый кобальт 0,001Вода водопроводная, л До 1 60 Для предотвращения вспенивания добавляют 300 мл 10%-ного "Плуроника Ь 81в соевом масле. Продукт ферментации собирают через 48 час и осветляют центрифугированием.100 л осветленного раствора перемешимют с 12 кг ионообменной целлюлозы Вазман ДЕ 32 в ацетатной форме,Шлам фильтруют, и комплекс ММ 4550элюируют с целлюнозы 12 л 0,5 М раствора сульфата калия. Экстракт концентрируютдо 6 л в выпарном пленочном аппарате ввакууме при температуре ниже 30 С. Сульфат калия осаждают 12 л ацетона, Растворфильтруют и концентрируют до обьема 200 млвьгпариванием в вакууме при температуреониже 30 С. Концентрат загружают в колонку (76 мм х 2 м), заполненную смолойфАмберлит ХАД-с," и элюируют деионизированной водой, собирая элюат фракциями по140 мл.Активные фракции собирают вместе(2,2 л) и концентрируют до 275 мл путемультрафильтроаания через мембраны АмиконЧ М - 0,5 (4 150 мм) под давлениемазота 420 и/м, Концентрат высушиваютвымораживанйем, получают 2,2 г коричневого порошка ( Д 0,004 мкг/мл).бо1 г порошка растворяют в 1 л 0,2 Мраствора сульфата натрия и смешивают с1 л 2%-ного (вес/обьем) раствора кислого сульфата тетра-н-бутиламмония в ди-хлорметане. Дихлорметановую фазу отделяют по весу, охлаждают до температуры - 70 оСфильтруют для удаления льда и концентрируют выпариванием до 20 мл.К концентрату прибавляют 400 мл петролейного эфира с т.кип. 40-60 С, и осадок собирают фильтрованием. Осадок вторично растворяют в 10 мл дихлорметана иэкстрагнруют 10. мл воды, содержащей .иодистый барий (80 мг) и карбонат бария(70 мг). фазы разделяют, водную фазуфильтруют.и величину рН устанавливают науровне 6,5. Раствор подвергают сушке вымораживанием, получают порошок желтогоцвета. Твердый продукт промывают ацетономдля растворения избытка иодистого бария,центрируют и выделяют светло-желтый продукт, который сушат в вакууме. Выход13 мг ( Л , 0,0004 мкг/мл),П р и м е р 2. Фильтрат культуры (см.пример 1) дает зону диаметром 17 мм приопределении бактерицидной активности припробе на КРеЬб 4 еОРа ааоЯеиед , зонудиаметром 38 мм при пробе КЛ 3 и величину Э, при разбавлении 1:10 Г)000,Осветленный фильтрат культуры (170 л)емпературой 5 С нереколируютв восходя- оощем потоке через колонку диаметром 22,86 см,заполненную до высоты 40,64 см активированным древесным углем "фарнелл ВОф счастицами размером 60-80 меш, предварительно промытого 1 н, соляной кислотой и 5забуференного до рН 6 фосфатным буфером(скорость 800-1000 мл/мин).Раствор промывают на угле деионизированной водой (10 л) и элюируют 20%-нымоацетоном при температуре 20 С. Активные 10фракции (10 л) концентрируют выпариваниемв вакууме при температуре ниже 30 С доообьема 6 л и высушивают вымораживанием.Получают 282 г сырого ММ 4550(комплекс), 3 0,05 мкг/мл.П р и м е р 3, Колонку диаметром 1 смзаполняют до высоты 6 см ионообменнойсмолой "Йауэкс 21 К (20-50 мин по стандарту США, хлоридная Форма). Слой смолыпромывают четырьмя порциями по 4,7 мл5% ного водного метанола, после чегопромывают 4,7 мл воды ( одной порцией)2 л фильтрата культуры получают как в примере 1 и переносят в колонку. Затем смолу промывают 504-ным водным метаноломо25для удаления загрязнений.ММ 4550 (комплекс) элюируют со смолы 5%-ным раствором хлористого натрияв 50%-ном водном метаноле.Ж)Фракции % 2-5 содержат 60% активноно вещества. Общий сухой вес этих фракций 210 мт.П р и м е р 4. К 10 л осветленногофильтрата культуры ( см. пример 1) прибавляют 248 г сульфата натрия. Полученный раствор экстрагируют 2%-ным раствором кислого сульфата тетра-н-бутиламмонияв дихлорметане (10 л) путем перемешивания в течение 30 мин. Фазы разделяют,идихлорметановую фазу охлаждают до температуры 2 оС. Небольшое количество суспендированной воды удаляют путем фильтрова-ния через бумагу Батман Х;)Р 3, Ди; хлорметановый раствор концентрируют дообьема 20 мл выпариванием в вакууме приотемпературе ниже 30 С. Смолу, содержащуюкомплекс, осаждают 400 мл петролейногоэфира при температуре 40-60 оС.Смолу собирают фильтрованием, повторно растворяют в 50 мл дихлорметана иэкстрагируют 50 мл воды, содержащей1 г иодистого бария и 1 г карбоната бария, встряхивая в течение 2 мин, Воднуюфазу, содержащую комплекс ММ 4550 вформе бариевой соли, доводят до рН 6,5и высушивают вымораживанием,Получают 317 мг сырого препаратаММ 4550 (комплекс) с показателемЭ,0,001 мкг/мл. 60 П р и м е р 5. Сырой препаратММ 4550 (комплекс), полученный по примеру 2, повторно растворяют в воде(12,5 г в 125 мл) и экстрагируют 125 мл10%-ного раствора кислого сульфата тетра-н-бутиламмония в дихлорметане, фазы разделяют, и дихлорметановую фазу подвергают обратной экстракции при помощи100 мл воды, содержащей 190 г иодистоого натрия, при температуре 2 С путем медленного перемешивания и установления величины рН водной фазы 6,4 2%-ным раствооом бикарбоната натрия, Раствор высушиваютвымораживанием, и твердое вещество промывают ацетоном.Получают 88 м (70%) препарата смешанных солей ММ 4550 и ММ 13902 с величиной Э 0,002 мкг/мл против )-лактамазы 5 ос Ь. с О Г.П р и м е р 6. 1 г сырого ММ 4550(комплекс), полученного по примеру 4, хроматографируют на сефадексея , исполь,зуя в качестве элюента смесь ацетон: во,да (4:6). Элюированне проводят со скоростью 1,5 мл/мин, активные фракции обьединяют, концентрируют в вакууме при темпера 1 туре ниже 30 С и подвергают сушке вымо раживанием.Получают 22 мг (88%) аморфного твердого вещества каштанового цвета и величиной Д 0,005 мкг/мл, очистка 405 ократная,П р и м е р 7. ММ 4550 (комплекс),полученный по примеру 5, хроматографируютна колонке с целлюлозой (2,5 см х 32 см,Ватман СС 31) и элюируют смесью изопропанола с водой ( 7;3 об/об) со скоростью,1,5 мл/мин. Бактерицидно-активные фракции обьединяют, концентрируют в вакуумепри температуре ниже 30 С и сушат вымораживанием, Получают 40 мт коричневогоаморфного препарата комплекса антибиотика с величиной Д 0,00007 мкг/мл.Очень низкая велич ййа Л р показывает,что активный материал о 1 ладет повьпценной степенью чистоты,П р и м е р 8. Фильтрат культуры(340 л), полученный по примеру 1, перколируют в восходящем потоке со скоростью800-1 200 мл/мин через колонку, ( д = 22 86 см, Ь =- 27 94 см), заполненную утлем "Фарнелл ВО, Колонку промывают 20 л воды и элюируют в нисходящем потоке смесью ацетона с водой(2;3 об/об) со скоростью 200-250 мл/мин.Собирают фракции обьемом 1 л. Фракции,содержащие ММ 4 550 (комплекс ), определяют постановкой пробы КЛС, обьединяют7пературе ниже 30"С до сбьема 5,5 л. Концентрат охлаждают до температуры 2 С,сприбавлякг 5,5 л 2%-ного (вес/обьем)кислого сульфата тетра-н-бутиламмония вдихлорметане с температурой - 5 С, и обефазы перемешивают 2 мин,Дихлорметановую фазу отделяют и прибавляют к 1 л 0,6%-ного раствора иодидаонатрия при температуре 0 С. Обе фазы ос 1 Оторожно перемешивают, и величину оН фазыопостепенно доводят до 6,5-7,0 2 Ь -нымвопным раствором бикарбоната натрия, Воднуюфазу отделяют и высушивают вымораживанием. Высушенный твердый продукт экстра,гируют безводным ацетоном пля растворения избытка иодида натрия, а ацетон удаляют из нерастворимого остатка в вакууме.Получают 1,1 г порошка каштановогсцвета. Степень очистки 125=.кратная.20Колонку диаметоом 2 5 см запогпгяютпорошкообразной целлюлозой (Ватман СС 31,в смеси изопропанола с водой (7;3) довысоты слоя 32 см, 500 мг порошка каштанового цвета растворяст в 2 мл смесиЯизопрспанола с водой (7:3) и хрсматогра-фируют с применением того же растворителя нри скорости элюирсвття 1,5 мл/мин.Из колонки собирают фракции обьемом по3 мл, и те фракции, которые показываютхарактерные максимумы поглощения придлине волны 285 нм, сбьепиня 1 ст, концентрируют и сушат вымораживанием для получения ММ 4550 (комплекс),Получают 35 мг коричневого амсра)ного вещества, величина 3 которогоО, 0001 мкг/мл, степень счистки 600-кратная.П р и м е р 9, Фильтрат культуры(1100 л) после ферментапии 51. . О 1( иъ сеоВАТСС 31126 с величиной рН 65и температурой 5 сС неркслируют соскоростью 3,3 л/мин через колонку(10,3 м х 1 м) пз гранулированного угля,Колонку промывают водой (60 л) и э;псируют смесью ацетон с водой (2;8 сб/сб)при температуре 80 С со скоростыс1,1 лlмин, Собирают 60 л, а последние 5фракций - по 10 л. Фракции (40 л), содержащие ММ 4550 (комплекс), сбьедипяют 50и концентрируют в вакууме при температуре ниже 30 С до обьема 32 л. Конценторат охлаждают дс температуры 5 С, прибавляют 16 л 0,2%-ного раствора хлсрида цетилдиметилбензиламмония в дихлор- М,сметане температурой 5 С и обе фазы перемешивают 5 мин.Дихлорметановую фазу отделяют и вносят в 3,75 л раствора исдистсго натрия(0,4%-ного) при температуре 5 С Обе 60 фазы перемешивают 5 мин, водную фазуотделяют, сушат вымораживанием. Высушенный твердый продукт экстрагируют безводным ацетоном для растворения избыткаиодистого натрия, и остаточное твердое вешество сушат в вакууме.Получают 2,87 г порошка рыжеватокоричневого цвета. Степень выделения комплекса на этой стадии 6%, степень очистки,160-кратная.Колонку диаметром 63 мм заполняютпорошкообразной целлюлозой (Ватман СС 3.1в смеси изопропанола с .водой (7:3) до высоты слоя 300 мм. 2,0 г порошка рыжевато-коричневого цвета растворяют в 5 млсмеси изопропанола с водой (7:3) и хроматогрфируют с той же системой растворителей со скоростью 3 мл/мин, фракции, содержашие ММ 4550 (комплекс), обьединяст, концентрируют выпариванием в вакууме при температуре ниже 30 оС и подвергают сушке вымораживаниемПолучают 207 мг гвердого вешествакоричневого цвета, Степень выделения наэтой стадии 51%, степень очистки 5-кратная,Колонку диаметром 16 мм заполняютпсрсшкосбразнсй целлюлозой (ВатманСС 31)в смеси н-пропанола с водой (4:1) до высоты слоя 300 мм. 198 мг коричневоготвердого вешсства раствосяют в смеси воды с н-пропанолом (1:1) и хроматографиру,.ст с системой растворителей н-прспанол.,вода (4:1) со скоростью течения 0,5 мл/мин.Ссбиржг фракции по 6 мл, провопят биоаналцз псотив КРеЬеИд ОеюяеигВ и снимают спектр поглощения каждой фракции вУФ-области, Фракции23-28 содержатдвунатриевую соль антлбиотика ММ 13902.Эти фракции сбьединяют, концентрируют ввакууме и подвергают сушке вымораживанием.Получают 30 мг твердого продукта,Фракции29-40 сспержат антибиотикММ. 4550, Эти фракции сбьединяюг, концентрируют в вакууме и сушат вымораживанием, Получают 53 мг твердого продукта, который содержит соль антибиотикаММ 4450, загрязненную небольшим колив:твом соли антибиотика ММ 13902,П р и м е р 10. Получение антибиотика ММ 13902. Пробу спор 5 ЕР.01 чосеОЯАТСС 31126 выдерживают в пробирках ссухой почвой в закрытом контейнере с агентом осушения при температуре 20 С. Необольшое количество пробы почвы (20 мг)переносят в колбу Эрленмейера обьемсм500 мл, содержащую среду следуюшего состава ( в г/л):20,0 10,0 До 1 рН устапав 5 Моногидрат глюкозы Мука, из соевых бобов Деионизированная вода, л.Перед стерилизацией валичинуливают 6,5. 2020До 115 Ферментационную среду перемешивают со скоростью 106 об/мии, температура ферменотации 30 С,. скорость аэрации 3 200 л/мин 60 Колбу с содержимым подвергаЬт инкубацоии в течение 30 час при температуре28 С, 2 мл инокулята высевают на твердый агар-агар в колбе Ру, 10Состав агар-агаровой среды:Овощной сок У, млАгар-агар, гДеионизированная вода, лрН среды до стерилизации 6;О,Колбу с содержимым инкубируют притемпературе 30 С в течение 2 дней, Затемизбыточную жидкость удаляют из колбы иинкубируют еше .4 суток.50 мл деионизированной воды, содержа Ощей 0,02% фТвина 80 ф, вносят в культурув колбе Ру, и споры суспендируют встряхиванием.Суспензию спор вносят в 75 л среды вбродильном чане обьемом 100 л.25Состав среды (в г/л):Мука из соевых бобов 10,0Моногидрат глюкозы 20,0Водопроводная вода, л До 1Для регулирования пенообразования к ЗОферментационной среде до стерилизации прибавляют 50 мл 10%-ного "Ъуроника Ь 81",Среду стерилизуют водяным паром в бродильном чане в течение 20 мин при температурео120 С, Культуру перемешивают со скоростью 140 об/мин и аэрируют стерильнымвоздухом со скоростью 75 л/мин.Температуру поддерживают на уровне28 С, и после инкубации в течение 48 часосодержимое чана прибавляют 1 к 1500 л сте орильной ферментационной среды в бродильном чане емкостью 2000 л,Состав ферментационной среды ( в г/л):Соевая мука 10,0Моногидрат глюкозы 20,0 45Мел 0,2Хлористый кобальт 0,001Сульфат натрия 1,0Водопроводная вода, л До 1500рН среды до стерилизации 6,0.Для предотвращения пенообразовдния всреду до стерилизации прибавляют 3 л10%-ного "Плуроыика Ь 81 в масле изсоевых бобов. рН среды после стерилизации 7,0 (устанавливают стерильным раствоэ 5ром гидрата окиси натрия),Продукт ферментации собирают через60 час и осветляют центрифугированием,Активность 340 ед/мл. фильтат культуры (1050 л) температурой 10 С и рН 8 экстрагируют дихлорметаном (810 л). Экстрагент содержит 1200 г хлорида цетилдиметилбензиламмония. фазы разделяют в центрифуге Шарплеса. Дихлорметановую фазу ( 1300 л) подвергают обратной экстракции водным раствором иодистого натрия (7 л воды и 210 г иодистого натрия), фазы разделяют по весу. Величину рН устанавливают 7,0-7,7 соляной кислотой и фильтруют.7 л экстракта, содержащего иодистый натрий, с активностью 21900 ед/мл про пускают через колонку, заполненную смолой "сефадекс Я АЕ" в фосфатном буфере (0,5 М), содержащем хлористый натрий (0,3 М), со скоростью 50 мл/мин при темпеоатуре 5 С. Колонку элюируют 0,7 М раствором хлористого натрия в 0,05 М фосфатном буфере с рН и при температуре 5 С со скоростью элюирования 25 мл/мин.2 л элюата отбрасывают и собирают 90 фракций.Фракции М 50-6 2 обьединяют, устанавливают рН 7, получают 1440 мл антибиотика ММ 13902 с активностью 71000 ед/мл. К объединенным фракциям прибавляют хла рпстый натрий (5 г/100 мл), и эту жидо кость перколируют при температуре 5 С через колонку, заполненную смолой Амберлит Х/)Д", со скоростью 20 мл/мин. Антибиотик ММ 13902 элюируют при комнатной температуре дистйллированной водой (200 мл), после чего элюируют водным 50%-ным метанолом,1 л элюата выпаривают при температуреониже 30 С при пониженном давлении до обьема 70 мл, устанавливают рН 7 и сушат вымораживанием. Получают 1,62 г коричневого твердого продукта, представляющего собой частично очишенную соль ММ 13902 с активностью 3700 ед/мл.1 г полученного продукта хроматогрфиру 1 от на колонке целлюлозы и элюируют смесью н-иропанола и воды (4:1) при скорости потока 2,5 мл/мин. 170 мл элюата отбрасывают и собирают 100 фракций по15 мл.Фракции М 3 7 4 3 (8 9 мл) содержащие двуиатриевую соль ММ 13902, выпаривактопри температуре ниже 30при пониженном давлении для удаления и-пропанола и сушат вымораживанием. Получают 219 мт желтоватого иороика с дктиисостью 73000 ед/л 1 л.Антибиотик ММ % 3902 представпяет 1, собой твердую карбоновую кислоту, находящуюся в форме натриевой сопи и имеюшую следующие ,"Ырактеристики:1. Хорошо растворим в водег метаноле и нерастворим в хлороформе, диэтиловом ейире и углеводородах.2, Максимум поглогпения в ультрафиоле.- товой области при длине олны 308 пм при показателе екстинкции Е, ", 343, 1 О3. Максимумы поглолпения в инфракрасной области при длине водны 3450, 2950, 1750, 1620, 15101400 и 1260 см4, Обладает бактерицидной активностью в отношении Яор 1 уЬсоссоб оженим,ИосгГ. 16 ,РОВ ООЬ 1 л Раду ЕВСгВРлСЬ 4 О СОРл г КВЬ 3380 РО 1 ое.-оценен,-Ргоецио ело ЫЬ 5,Зоей еопеР 1 Ьур 8 лРВЕийллгцггОВ ОВРлгл глоба,5. Оказывает глнергетическое воздействие в сочетании с пенигпглггглиом и пефалоспоринами. формула изобретения Способ получения антибиотика или его солей, о т л и ч а ю щ и Й с я тем, что культуру ЯгерломусеВ айюэсепВ АТСС 31126 выращивают в аеробных условиях на среде, содериашей источники углерода и азота, минеральные соли, с последующим выделением антибиотического г омплекса и разделением его на компоненты известными приемами, Составитель Г, Смирнова Редактор Л. Ушакова Техред И. Асталоиг Корректор Н. ЗолотовскаяЗаказ 711/39 Тираж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, уп, Проектная, 4