Способ получения динуклеотидов

(51)м. Кд С 07 Н 21/ООО А 61 К 31/00 с присоед,инением заявки РЙ Государственный комитет(23) Приоритет Опубликовано 30.04.80. Бюллетень И 16Дата опубликования описания 30,04,80 по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения В. Ф. Зарытова, Т. С. Ломакина и В. П, Старостин Новосибирский институт органической химии Сибирского отделения(71) Заявители АН СССР и Новосибирский государственный университет(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИНУКЛЕОТИДОВ 2Недостатком известного способа является применение на стадии образования Цель изобретения - упрощение процесса. Поставленная цель достигается тем, что в способе получения динуклеотидов применяют 2-3 кратный избыток цианэтанола, а в качестве конденсирующего агента стадии цианэтилирования -триизопропилбензолсульфонилхлорида, что позволяет избежать применения ДЦК, обладающего аллергенными свойствами и уменьшить пожаро 41 Л 111. 1Изобретение относится к усовершенст. вованному методу получения динуклеотидов, которые используются для синтеза фрагментов нуклеиновых кислот, необходимых для исследований в молекулярной биологии, биохимии, и генной инженерии.5 Известен способ получения динуклеотидов, включающий цианэтилирование (получение моноцианэтильного производного) нуклеотида избытком (18-60 крат 1 О ным) цианэтанола и присутствии конденсирующего агента - дициклогексилкарбодиимида (ДЦК); цианэтильное производное выделяют из реакционной смеси15 экстракцией ДБК циклогексаном и осаждением производного из раствора серным эфиром при -10 С, с последующей конденОсацией полученного цианэтильного производного нуклеотида с нуклеотидным компонентом в присутствии конденсирующего агента триизопропилбензолсульфонилхлорида (ТПС). Выход целевого продук. цианэтильных производных конденсирующего агента ДЦК, обладающего ярко выраженными аллергенными свойствами(особенно опасны его пары и эфирныерастворы), и повышенная взрыво- ипожаро-опасность процесса вследствиеприменения больших количеств огнеопасных растворителей (серный эфир и циклогексан для удаления ДЦК).опасность процесса при выделении цианэтильного производного в результате замены экстракции циклогексаном (ДЦК)и осаждения в серном эфире обычнойхроматографией, например на силикагеле в системе хлороформ-метанол. Кроме того, в качестве фенил (низший) алкилпроизводных применяют триизопропилбензолсульфонилхлорид илимеэитиленсульфонилтриазолид (МСТ).Выход целевого продукта 32-40%,П р и м е р. 1. Синтез 5 -фосфорилдеэокситимидилил-(3 -5 ) дезокситимидина Д (рТ-Т) с использованием дицианэтилового эфира (б СЕ рТ), полученногос помощью ТПС,2а) Бианэтилирование 5 рТ.Смесь 1,37 г (4 ммоль)дезокситимидинфосфата ЯрТ), 0,68 мл цианэтинола (СЕОН) высушивают упариваниемс абсолютным пиридином.Остаток после упаривания растворяютв 16 мл пиридина, добавляют в раствор3,64 г (12 ммоль) ТПС и встряхиваютреакционную смесь 20 ч при комнатнойтемпературе в условиях, исключающихпопадание влаги. При охлаждении до 0 СОк смеси прибавляют 16 млпредварител 1.-но охлажденной воды, выдерживают 3 чпри 4 С. Реакционную смесь концентриоруют в вакууме до минимального объемаи упаривают трижды с 30 мл воды. Добавляют 45 мл воды и отфильтровываютосадок. фильтрат упаривают досуха, высушивают упариванием с бензолом. Остаток после упаривания растворят в 40 млсмеси хлороформ-метанол (9:1 Ч(Ч ) инаносят наколонку с 200 мл силикагеля(0,146-0,315 мм). Хроматографируатсначала в линейном градиенте метанолав хлороформе (400 мл СНС - 400 млсмеси СНСВ - СНОН, 8:2 Ч/ч), затем400 мл смеси (СНСВЗ - СНОН, 1:1 Чч),собирая фракции по 8 мл/10 мин. фракции 7090 (32000 О Ееу ) упаривают,получают маслообраэный остаток, содержащий 2,7 ммоля СЦрТ (67,5% в расчетенад рТ).б) Конденсация нуклеозидного компонента (бСЕ рТ) с нуклеотидным компонентом (дрТ-ОАс).1,9 г (4,2 моль) 3-0-ацетилтими.дин-фосфата (дрТ-ОАс) высушиваютупариванием с абсолютным пиридином,Остаток растворяют в 10 мл пиридина,добавляют в раствор 4 г (13,2 моль)ТПС и выдерживают реакционную смесь1-3 ч при комнатной температуре в услвиях, исключающих попадание влаги.К полученному активному производномунуклеотидного комчонента приливают раствор 2,7 мольдСЕрТ в 6 мл пиридини выдерживают смесь 6 ч при комнатнойтемпературе, При охлаждении до О С кореакционной смеси прибавляют предварительно охлажденные 20 мл воды и выдер живают 12 ч при 40 С. Охлаждают реакционную смесь до ОоС, приливают 48 млохлажденного до ОоС раствора 2 н,МаОН и выдерживают 45 мин при ОдС.Нейтрализуют реакционную смесь 300 мл 15 смолы КРСП (Р, Н)до рН 8, переносят массу в колонку со 100 мл смолыКРС - 2 П (Р Н+) и промывают колонку1,5 л 30%-ного раствора пиридина вводе. Элюат упаривают досуха, растворяют ро в 500 мл раствора триэтйламмонийбикарбоната (ТЭАБ) и наносят на колонкус 200 мл ионообменной смолы ДЭАЭмолселект А(НСО, 2,6;34 см).Хроматографируют в лйнейном градиенте г 5 ТЭАБ (3 л 0,05 М - 3 л 0,35 М),собирая фракции по 20 мл/20 мин. Иэфракций 276-350 выделяют 260000,Е,динуклеотида д(рТ-Т). Выход 32% (врасчете надрТ). Я (рТ-Т) относительноЗО дрТ в системе ЙНОЬс, ЕВОН (37) 091 е 35 40 45 5 о 55 Его/Еоо 0,66; Егво/Егео=0,72; Его /Ег о=0,26, Содержание нуклеотидного материала в полученном продукте 94,3 Уо, содержание динуклеотида по данным микроколоночной ионообменной хроматографии 97%.П р и м е р 2. Синтез 5 -фосфорил- -И -анизоилдезоксицитидилил-(3 -5 )- 1Яо - И-иэобутирилдезоксигуанозин д (рСВо8 ) с использованием моноцианэтилового эфира (бСЕрС ), полученного с помощью ТПС.а) Цианэтилирование дрСЯтСмесь 1,66 г (3,2 моль) пиридино 7 вой соли М -аниэоилдезоксицитидин- -фосфата (дрС ), 3,2 ммоля трибутиламина (ТБА) в пиридине и 0,68 мл (9,2 ммоль) цианэтанола (СЕОН) высушивают упариванием с абсолютным пири- дином. Остаток после упаривания растворяют в 16 мл пиридина, прибавляют к раствору 3,64 г (12 ммоль) ТПС и выдерживают реакционную смесь 1,5 ч при комнатной температуре в условиях, исключающих попадание влаги. При охлаждении до (-20) Со к смеси добавляют 16 мл воды и выдерживают 12 ч при 40 С, Упаривают реоакционную смесь досуха, остаток вы 5 7306 сущивают 3-кратным упариванием с диоксаном, растворяют в 20 мл смеси хлороформ-метанол (1:1 Ч/Ч), В раствор добавляют 50 мл сипикегеля.(0,140-0,315 мм).( тщательно перемешивают массу и с помо щью вакуума уделяют из нее растворитель, Полученную сухую массу наносят на .колонку с 200 мл силикагеля (0,140- 0,315 мм). Хроматографируют сначала в линейном градиенте метанола в хлоро О форме (700 мл СЯСЬ - 700 мл смеси СНС 4 - СНОН 8:2 Ч/1, затем 300 мл смеси (СНС., - СНОН, 1:1,(/Ч), собирая фракции по 10 мл/10 мин, Из фракций 55-76 выделяют 14700 О.Е.ВСЕ рС в(21% в расчете ваорСвав 1, из фракций 78-155-32000 О.Е.ОдСЕрС "Р 1 (46% в расчете неорС).б) Конденсацич. нуклеозидного компонента (дСЕрС 4") с нуклеотидным ком понентом (др 6,.,). Смесь 0,7 ммольЦрСЕрС и 2,18 г (3,9 моль) (10-диизобутирилдезоксигуанозин-фосфата (бра ," ) высушивают упариванием с абсолютным пиридином, растворяют в 7 мл пиридина, Прибавляют к раствору 1,95 г (7,8, моль) МСТ и выдерживают реакционную смесь30 в течение 5 сут. в темноте в условиях, исключающих попадание влаги, При охлаждении до(-20)оС. к реакционной смеси прибавляют предварительно охлажденные 16 мл 1 м раствора триэтиламина (ТЭА) . в пиридине и 8 мл воды и выдерживают .35 12 ч при 4 С. Охлаждают реакционнуюосмесь до (-10)оС, прибавляют 39 мл предварительно охлажденного дэ (-6) Со раствора, 2 н. 11 еОН и выдерживаюто 40 20 мин при 0 С, Нейтрализуют реакционную смесь 200 мл смолы КРСП (Р(Н+) до рН 8, переносят массу в.колонку со 100 мл смолы КРСП (Р Н+) и промывают колонку 1 л 20%-ного раст45 воре пиридина в воде. фильтрат уперивеют досуха, растворяют в 200 мл 0,05 М ТЭАБ и наносят на колонку с 200 мл ионообменной смолы ДЭАЭ-молселект А(НСО, 2,6 34 см). Хроматогра 50 фируют в лийейном градиенте ТЭАБ в 10 Ъ-ном спирте (1,5 л 0,05 М - 1,5 л 0,4 М), собирая фракции по 12 мл/8 мин, Из фракций 155-220 выделяют 1,3000 О.Е динуклеотида о(рС - б). Выход 64% (в расчетещ 80 55 надСЕрС П), К д (рСАп С%о) в системе (чН 4 ОАс: Е 1 ОН 0,7; 2260/Ево94 р Еф/Ж 50 1,13 Содержание 91 6нуклеотидного материала 95%, содержание динуклеотида по данным микроколо-,ночной ионообменной хроматографии 97%.П р и м е р 3. Синтез 5 -осфорил - И -изобутирилдезоксигуанилил-(3 -5 )-Н -анизоилдезоксицитозина д (р 61 ЬоС) с использованием моноцианэтилового эфира (дСЕрС "), полученного спомощью ТПС,ВКа) Пианэтилирование дрЯБианэтилирование М -ивобутирилдезоксигуанозин-фосфата (др(8) проводяткек описано в примере 2 за исключениемтого, что смесь 2 г (4, моль) трибутиламмонийной солидрб", 0,68 мл(9,2 ммоль) СЕОН выдерживают в течение 1 ч с 3,64 г (12 моль) ТПС.После обработки реакционной смеси пр.водят хроматографию на силикагелеэлюируя сначала 700 мл раствора смесиСНС 6-СН ОН (8;2,М/Ч), зетем линейнымградиентом метанола в хлороформе(500 мл смеси СНС 6 - СН 5 ОН, 8:2,500 мл смеси СНСЬ - СНОН, 23,У/У), собирая фракции( по 7 мл/10, мин.Из фракций 40-95 выделяют 11300 О.Е.рорСЕ рб (17% в расчете недра ), .из фракций, 190-240-27000 О.Е.,-,(40%)д СЕр .б) Конденсация нуклеозидного компо-нента (дСЕрЕ( ") с нуклеотидным компонентом (дрС, 4,.Конденсацию проводят как описано впримере 2 б за исключением того, что вреакцию берут 28 г (4,8 моль) пиридиновой соли 3 -С ацетил- й-анизоил(дезокспцитидин-фосфета, 1,6 ммольЬСЕр( " и 2,51 г (10,0 моль) МСТ.После обработки реакционной смеси иудаления защитных групп хроматографируют в линейном градиенте ТЭАБ в10%-ном спирте (3 л 0,05 М - 3 л0,4 М) собирая фракции по 12 мл/8 мин.Из фракций 155-220 вьщеляют 25000О.Е. динуклеотцда 3(р 6 ц- С Ао )Выход 52% (в расчете надСЕ р );АДЬОК 0,7 в системе ЙНОАс-Е(.ОН (3;7,Содержание нуклеотидчого материала95%, содержание динуклеотида по данныммикроколоночной ионообменной хроматографии 97%.П р и м е р 4. Синтез динуклеотидад рТ-Т) без предварительного дицианэтильного производного, полученного спомощью ТПС.Получение динуклеотида проводяттак семо как описано в примере 1 зе1. Способ получения динуклеотидов,включающий цианэтилирование нуклеотидаизбытком цианэтанола в присутствииконденсирующего агента с последующейконденсацией полученного цианэтильногопроизводного нуклеотида с нуклеотиднымкомпонентом в присутствии фенил (низший ) алкилсульфонилпроизводных, о т -л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения процесса, применяют 2-3кратный избыток цианэтанола, а в качестве конденсирующего агента стадии цианэтилирования - триизопропилбензолсульфонилхлорнда,2. Способ по п. 1, отличаю -щ.и й с я тем, что в качестве фенил(низший), алкилпроизводных применяюттриизопропилбензолсульфонилхлорид илимезитиленсульфонилтриазолид.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Бадашкеева А. Г., Берлин Ю. А,и др. Синтез олиго- и полинуклеотидов,ХПС, 1973, М 3, 394 (прототип).3 ЪфФ,;1(У773069 исключением того, что к реакционной смеси, полученной при взаимодействии 207 г (6,4 ммоль) триэтиламмонийной соли брТ и 1 мл (14,9 . моль) СЕОН с 5,45 г (18 моль) ТПС, приливают5 раствор активного производного нуклеотидного компонента, полученного при взаимодействии 5,85 г (13,2 моль) пиридиновой соли ДрТОАс с 11,8 г (39:моль) ТПС. После разложения реакционнойо смеси, как описано в примере 1 б 50 мл воды, удаляют цианэтильные и ацетильные защитные группы с помощью обработки 60 мл концентрированной МНОН в течение 5 ч при 60 оС, Упаривают раствор 15 и огфильтровывают осадок. фильтрат разбавляют водой до 3 л и наносят на колонку с 750 мл ионообменной смолы ДЭАЭ - молселект А(НСО, 40" 5 см), Хроматографируют в линейном градиенте 2 о ТЭАБ (0,0 М 5 л - 0,5 М 5 л), собирая фракции по 42 мл/7 мин. Из фракций 230-272 выЪеляют 49000 О Е рв динуклеотидад(рТ-Т). Выход 40% (в расчете на ЙрТ). Цродукт идентичен по качеству продукту, полученному в примере 1. 1 8фор мула из об ретенияСоставитель Л. НикулинаРедактор В, ЗарванскаЯ Техред М. Кузьма Корректор М. ШарошиЗаказ 1449/7 Тираж 495 ПодписноеЦНИИГ 1 И Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул, Проектная, 4