Способ получения над-зависимой формиатдегидрогеназы

П 9) (30 СО)ОЭ СОВЕТСКИХНОРУРСРРРШИКРЕСПУБЛИК Збо С 12 н 9 04ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСНОНУ СВИВСТВЪСТВУ(56) 1.КаСо Я., Капо М., Тап 1 Л., ОваСа К "Рцг 11 саС 1 оп апй СЬагасСег 1 хвС 1- оп о РАогваСе РеЬудгоаепаае 1 п ИеСЬа- по 1 цС 111 х 1 пЕ ТеааСК 1 оеЬегв вр. Б 2201" Акг. В 1 о 1. СЬев, 38,1974, 111-116.2. Екогоч А,М., АчИочв Р 1 Р.Ч., 01 Ьоч М.М Ророч Ч.О Вов 1 опоч Т,Ч. Вегех 1 п 1.Ч. "лАЭ-йерепбепС РогщвСе. ЭеЬуйгоепаве Ггощ МеСЬу 1 оСгорЬ 1 с ВвсСег 1 цщ. 8 Сга 1 п 1. Рцг 1 г 1 саС 1 оп аэй сЬайасСег 1 хаС 1 оп". Ецг. Ю.В 1 осЬещ, 99 у 1979, 569-576.3ВсЬцССе Н.У 1 оевйогР У., .ЗвЬщ Н.Кц 1 а М.-В. "РцгдГ 1 свС 1 оп апй ргорегС 1 ев оГ Гогвв 1 цеЬуйе 6 еЬудго 8 епаае апй гогщвСе йеЬуйГобепазе ггощ Свпй 1 Га Ъохй 1 п 1", Ецг.Ю.ВЬосЬещ. 62, У 1, 1976 В 151-160.(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАД-ЗАВИСИМОЙ ФОРМИА 1 ДЕГИДРОГЕНАВЫ, предусматривающий культивирование продуцирующих ее дрожжей рода СвпсЫв при аэрации на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и,спирт в качестве источника углерода, с последующим выделением фермента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повнаения активности целевого продукта и эффективности процес .са, в качестве продуцента используют штамм дрожжей Сапс 14 а щеСЬу 11 св ИБФМ У, культивирование ведут в проточных условиях, а в качестве источника углерода используют этиловый Е спирт и формиат натрия в концентрации Оу 01-Оу 1 и Оуоз-Оу 07 соответ ственно от объема питательной среды, при этом формиат натрия вносят при достижениикультурой .эксцонен;циальной фазы роста.Изобретение относится к микробиологической промьдаленности, аименно к способам получения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы издрожжей, и может найти применениен фармацевтической, медицинской промышленности, а также для научныхисследований,НАД-зависимая Формиатдегидрогеназа катализирует окисление формиата до двуокиси углерода при сопряженном восстановлении НАД+ до НАДНВ связи с этим формиатдегидрогеназаможет найти применение н окислитель.но-восстановительных процессах, связанных с регенерацией кофактора, 15например при модификации стероидов,получейии аминокислот, а также в биоэлектрохимических системах окисленияорганических соединений для создания топливных элементов, н которыхНАДН выполнял бы функцию переносчикаэлектронов с органических соединений на электрод.Изнестны высокоочищенные препараты Формиатдегидрогеназы, выделенные г)з метанолиспользующих дрожжей К 1 оесКега ар. 2201 1 3 и метанолиспользующих грамотрицательныхбактерий штамма Р 1 2 3. Однако укаэанные высокоочищенные ферментныепрепараты обладают недостаточновысокой каталитической активностью,Кроме того, в качестве источникауглерода в питательной среде длякультивирования микроорганизмов-продуцентов используют метиловый спирт, 35что усложняет процесс наращиваниябиомассы и снижает его эффективностьтак как возникает необходимостьочистки сточных вод.Наиболее близким по технической 40сущности и достигаемому результатук предлагаемому способу являетсяспособ получения НАД-зависимой Формиатдегидрогеназы, предусматривающий.культивирование продуцирующих ее дрож жей рода Сапйда при аэрации на синте тической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и 2-ный метиловыйспирт в качестве источника углерода, с последующим выделением фермента Г 31;Недостатками способа являютсяпериодические условия культивирования, которые не позволяют поддержи. вать культуру в одном и том же Физио-логическом состоянии с высокой ферментативной активностью, а такженедостаточно высокая активность фермента, составляющая 0,13 мкМ/глин мгбелка для бесклеточного экстракта 60и 2,4 мкИ/мин мг белка для очищенного фермента,Кроме того, применение в качестве источника углерода метиловогоспирта усложняет культинирование в 65 производственных условиях, так какон летуч и токсичен. В этом случаенеобходима очистка сточных вод отметанола,Цель изобретения - повьдление активности целевого продукта и эффективности процесса.Цель достигается тегл, что вспособе получения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы, предусматривающемкультивирование продуцирующих еедрожжей рода Сапййа при аэрациина синтетической питательной среде,содержащий источники азота, фосфора,минеральные соли и спирт в качествеисточника углерода, с последующимныделениегл Фермента, в качестве продуцента используют штамм дрожжейСаййда иеЬу 11 са ИБФИ У, культивирование ведут в проточных условиях, н качестве источника углеродаиспользуют этиловый спирт и Формиатнатрия в концентрации 0,01-0,1 и0,03-0,07 соответственно от объемапитательной среды, при этом Формиатнатрия вносят н среду при достижениикультурой экспоненциальной фазыроста.Повышение эффективности процессапроисходит в результате культивиронания в условиях протока, прикоторых культура поддерживается водной и той же фазе рбста при постоянной концентрации источника углерода в среде, что является необходимым условием для получения высокойформиатдегидрогеназной активности.Проточное культивирование позволяет получать большие количествабиомассы, чем периодическое, а использование в качестве источникауглерода этилового спирта вместометилового значительно упрощаеттехнологию, что также приводит кувеличению эффективности процесса.Способ осуществляют следующимобразом.Дрожжи Сапййа ше 1 Ьу 1 са ИБФМУкультивируют на синтетической питательной среде следующегосостава, г/л: (БНЛ.) НРО 4 0,5;(ИН 4) НРО, 1,5; КТО4; Мд 804 0,25дрожжевой антолизат 0,01) этиловыйспирт 0,01-0,1 по объему, Культивирование проводят в Ферментере внепрерывно-проточном режиме с коэффициентом разбавления 0,1 ч ", прирН 6,0, Формиат натрия в концентрации 0,03-0,07 Ъ вносят в среду через 6-8 ч от начала культивированияпри достижении культурой экспоненциальной Фазы роста.Для выделения фермента биомассуразрушают иа СР-дезинтеграте путемрастирания со стеклянными бусамицентрифугируют при 4 000 б н течение 1 ч, Надосадочную жидкость используют для выделения и очистки871525 ВНИИПИ Заказ 1138/5 Тираж 522 Подписное Ю ЕЮЮ ЮЮ евфилиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул.Проектная, 4 Формиатдегидрогеназы. Гомогенный фермент получают ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе с последующей гельфильтрацней на сефадексе 0-200, Активность полученного гомогенного препарата формиатдегидрогеназы составляет 16 мкм/мин мг белка,П р и м е р 1;,В качестве продуцента используют штамм метилотроф. ных дрожжей Сапй 1 йа ые 1 Ьу 11 са ИБФМ У, который хранится в коллекции института биохимии и Физиологии микроорганизмов АН СССР в г. Пущино-на-Оке. Штамм защищен авторским свидетельством Р 449933,кл. С 12 С 11/18.Дрожжи культивируют на минеральной среде следующего состава, г/л: (БН 4) НРО 4 0,5 Р НН 4 НР 04 1,5;КБО 4,0 р М 8804 0,25 у дрожжевой автолизат 0,01 . Вода дистиллированная. Значение рН среды доводят до 6,0 соляной кислотой. Стерилизация среды проводится 20 мин при 1 атм. Этиловый спирт, используемый в качестве источника углерода, добавляют в среду после стерилизации в. количестве 0,05 по объему.формиат натрия в концентрации 0,04 вносят в среду через 6 ч от начала культивирования при достиже нии культурой экспоненциальной фазы роста.Культивирование проводят в ферментерах Фирмы ЛКВ (Швеция) или .Вгаип Ме 1 вип 8 еп (ФРГ) в непрерывно- проточном режиме по хемостатному принципу. Для предотвращения вспенивания в среду добавляютсиликоновое масло (0,01). Среду подают регулируемыми перистальтическими насосами, коэффициент разбавления Д 0,1 ч, Аэреацию проводят воздухом,из расчета 1 об. в юлин/1 об. среды. Ско рость вращения мешалки 400 об/мин, температура 28 С, Значение рН среды поддерживают постоянным (6,0) путем автоматической подачи щелочи (0,5-ной БаОН). За ростом культуры следят, измеряя плотность суспензии. Выходящую из ферментера суспензию клеток охлаждают до 2 фС и подвергают сепарированию на супер центрифуге при 2800 об/мин, Отсепарированные клетки (20 г) суспендируют в 40 мл 0,05 М фосфатного буфера (КНРО 4-БаОН, рН 7,5), содержащего 1 мМ дитиотреитола, и разрушают на СР-дезинтеграте (Швеция) при скорости вращения мешалки 3000 об/мин в течение 25 мин. Дезинтеграт центрифугируют в течение1 ч при 4000 д, Надосадочную жидкость используют в качестве бескле 5точного экстракта. Полученный бесклеточный экстракт обладает формиатдегидрогеназной активностью, равной0,54 мкМ/мин тамг белка. Выделение иочистку фермента до гомогенногосостояния проводят согласно следую(О щей методике: бесклеточный экстрактразводят в 2,5 раза дистиллированной водой и наносят на колонкус ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную0,02 М фосфатным буфером, содержа 15 щим 1 мМ дитиотреитола, формиатдегидрогенаэу элюнруют 0,1 М раствором НаС 1 в этом буФере,Гомогенные препараты формиатдегидрогеназы получают гельхроматогра.фией в колонке с сефадексом С образцов, полученных в результатеионообменной хроматографии наДЭАЭ-целлюлозе. Активуость гомогенного препарата формиатдегидрогеназы, полученного гельфильтрацией,составляет 16 мкМ/мин мг белка.П р и ме р 2, Дрожжи Сапй 1 йащег,пу 11 са ИБФМ Увыращивают со;гласно примеру 1, В качестве источ.ика углерода используют этиловыйспирт в концентрации 0,050 и формиат натрия в концентрации. 0,01.формиатдегидрогеназная активностьбесклеточного экстракта составляет.0,26 мкМ/мин мг белка. АктивностьЗ 5 гомогенного препарата равна7 мкМ/мин мг белка.П р и м е р 3, Дрожжи СапйЫаше 1 Ьу 1 са ИБФМ Увыращивают согласно примеру 1, В качестве источ 40 ника углерода используют этиловыйспирт в концентрации 0,1 и формиат натрия в концентрации 0,07.Формиатдегидрогеназная активностьбесклеточного экстракта составляет0,30 мкМ/мин мг белка. Активностьгомогенного препарата Формиата равна 8 мкМ/мин мг белка.Предлагаемый способ позволяет(получить НАД-зависимую Формиатдегид 50 Рогеназу с высокой Ферментативнойактивностью (в 6-7 раз выае, чем визвестном способе), а также повысить эфФективность процесса путемприменения проточных условий культивирования и использования нетоксичного этилового спирта и формиата в качестве источника углерода.Кроме того, выделение гомогенногофермента осуществляют в три стадиив отличие от пяти стадий, испольэуе 4 О мых в известном способе.