Способ получения сайт-специфической эндонуклеазы

(19) 01) й 15/00; С 12 й 9/1 О ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(71) Научно-исследовательский институт медицинской энзимологии АМН СССР(56) 1. ЯгпЮ Н. О. ет а 1. 1.Мес 1.В 1 о 151, а, 79, 1970.2. ВоЬегта В. 1, Йис 1. Аг 1 да Веа, 10, 5,1982,3. ВцЬп В. М а 1. Метпода 1 п Епугпо 1 о -ду, 65, 96, 1980,(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ САИТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ЕСО В 1, включающий культивирование штамма Е-Со 11 ВУ 13,разрушение клеток, очистку фермента, о т .личающийся тем,что,сцельюповышения чистоты эндонуклеазы Е,со В 1,очистку фермента ведут путем хроматографии субстрата на голубой сефароэе с после.дующим изоэлектрофокусировавием прирН 3,5 - 10 в градиенте плотности глицерина0,1 - 60% и отбором фракций при р 1 7,7-8,0.1120019 1Изобретение относится к микробиологиии касается способа получения сайт-специфи.ческой эндонуклеазы ЕсоВ 1,Рестриктазы широко используются в молекулярно-биологических, генно. инженерных игенетических экспериментах каК уникальный инструмент для получения и анализарекомбинантных ДНК, выделения индивидуаль.ных генов, картирования геномов прокариот,изучения первичной структуры ДНК. Использование рестриктаз основано на том, чтоэти ферменты являются сайт-специфическими,узнают и расщепляют в двунитевой ДНКопределенные уникальные нуклеотидныепоследовательности - сайты. Первый ферменттакого типа выделен в 1970 году Смитом исотр Г 1) .В настоящее время вьщелено более 280рестриктаз, узнающих 85 типов различныхпоследовательностей нуклеотидов 2 .В то же время успешное использованиерестриктаз для получения рекомбинантныхДНК л чтго, встраивания в векторныемолекулы, получения фрагментов ДЙК и т.д,возможно только в том случае, когда используемый способ выделения фермента обеспечивает отделение этого препарата от других,присутствующих в объекте рестриктаз. Однойиз рестриктаз, наиболее широко используемыхво всех видах молекулярно-биологическихи генно-инженерных работ, является рестриктаза Есо Я 1. Объектом для выделения рестриктазы ЕсоЯ 1 служат клетки Е.со 1, содержащиеплазмиду В 1, которая детерминирует синтездвух специфических эндонуклеаз (рестриктаз)ЕсоЯ 1 и ЕсоЯ 1, имеющих родственные сайтыузнавания.Рестриктаза ЕсоЯ 1 имеет 5 точек расщепле.ния на ДНК фага лямбда и 1 точку расщепления на ДНК плазмиды рВЯ 322 и узнаетуникальную шестичленную последовательностьнуклеотидов 5.Оптимальными условиями для действия рестриктазы ЕсоВ 1 являются высокая ионнаясила и нейтральные значения рН.45 Сайтом узнавания для рестриктазы ЕсоЯ, является четырехчленная последовательность нуклеотидов 5ААТТЗ , Фермент имеет девять точек расщепления на ДНК плазмиды рВВ 322 и более 20 точек расщепления на 50 ДНК фага лямбда, наиболее активен в среде с низкой ионной силой при щелочных значениях рН, в присутствии гицерина и ионов Мп . Однако свежевьщеленный фермент в высокой концентрации способен расщеплять 55 субстрат как и рестриктаза ЕсоЯ 1, в среде с высокой ионной силой при нейтральных .значениях рН. 1Ввицу того, что сайты узнавания для рест-,риктаз ЕсоЯ 1 и ЕсоЯ 1, частично совпадают,определение активности рестриктазы ЕсоЯ всмеси ферментов ЕсоВ и ЕсоЯ в следую.щих случаях невозможно.При совместном (одновременном или последовательном) воздействии на субстрат двумя или несколькими специфическими эндонуклеазами, одной из которых является рестриктаза ЕсоЯ 1. Процецура совместного гидролиза субстрата различными рестриктазамишироко используется в молекулярно-биологических экспериментах для картирования вирусных и плаэмидных геномов, при определениипервичной структуры фрагментов ДНК, приидентификации сайтов, узнаваемых рестрикта-.зами. В таких экспериментах варьирует ионная сила среды, значение рН и набор катионов, вводятся стабилизирующие факторы типаглицерина, что в случае ЕсоВ и ЕсоЯ 1,ферментов приводит к резкой активацииЕсоЯ, рестриктазы и полному маскированию.действия рестриктазы ЕсоЯ 1 за счетпоявления большого количества ЕсоЯ 1 -специфических фрагментов ДНК.Появление ЕсоВ -специфических фрагментов ДНК имеет место при использовании свежевыделенного ферментного препарата. Вэтих случаях рестриктаза ЕсоЯ, как иресгрикгаза ЕсоВ 1, способна гидролизоватьсубстрат в среде с высокой ионной силойпри нейтральных значениях рН. Из сказанногоследует, что получение рестриктазы ЕсоВ 1,свободной от сопутствующего ферментаЕсоВ 1 , является обязательным условиемвсестороннего использования рестриктазыЕсоЯ 1 в молекулярно-биологических работах.Способы получения рестриктаз традиционны.Получение рестриктазы ЕсоЯ 1 состоит из рядаэтапов; накопление бактериальной массы.разрушение клеток; получение грубого экстракта, освобождение от нуклеиновых кислот,высаливание, катионообменная хроматографияна фосфоцеллюлозе РН, анионообменная хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе, адсорбцион.ная хроматография на гидроксиапатите, афинная хроматография на ДНК-целлюлозе, стаби.лизирующий диализ 13,Однако ионообменники и адсорбенты обла, -дают незначительной емкостью, в результатечего значительная часть материала либо несвязывается с обменником, либо связываетсянеспецифически и обнаруживается в оттекающейжидкости или при промывке обменникавместе с балластным белком, нуклеазами иепротеазами. Такой материал загрязнен, песта.билен и в дальнейших экспериментах не используется. Причем разрешающая способностьанионообменников и адсорбентов недостаточна3 11 гООдля белков со сходными физико. химическимисвойствами, а использование афиццой хроматографии не обеспечивает фракционированиябелков, обладающих близким сродством ксубстрату,5Таким образом, указанные типы колоцоч.цой хроматографии не обеспечивают разделе.ция специфических эцдонуклеаз ЕсоВ иЕсо В .Предлагаемый способ исключает использование иоцообменной и адсорбииоцной хроматографии, заменив ее двустадийным фракииоцировацием, На афиццом сорбецте - голубойсефарозе и изоэлекгрофокусировацием ца амфолинах в градиенте рН и плотности гчииерина.Способ хроматографии ца голубой ссфдрозеявляется оптимальным ца первой стадииочистки рестриктирующих эндоцуклеаз, таккак позволяет фракциоцировать ферментынепосредственно из грубого экстракта, цсклю.чив традиционные стадии осаждения нуклеиновых кислот и высдливация белков. Высокая емкость и разрешающая способностьголубой сефарозы дают возможность провести с высокой эффективностью очистку фермента от неспецифических цуклеаз из любогозаданного кнличсства бактериальной пасты.Разделение белков методом изоэлектрофоку.сирования основано на способности белков30мигрировать в условиях электрофореза взону рН, соответствующую изоэлектрическойточке (ИЭТ) данного белка. Поскольку значение ИЭТ является уникальной характеристикойкаждого белка, то различные белки отличаютсядруг от друга по этому признаку. Высокаяразрешаю 1 иая способность метода изоэлектрофокусирования позволяет разделять белки, значение ИЭТ которых различается ца 0,2 ед рН.Принцип фракционирования при условииправильного подбора крутизны градиента обеспечивает высокую степень концентрированияиндивидуального белка в узкой зоне, высокуюемкость колонки, эффективное отделение отбалластных и интерферирующих ферментов,высокую чистоту полученного препарата, Выходбелка значительно превышает таковой посравнению с другими видами колоночной хроматографии, так как процедура исключает потери за счет материала, це связавшегося собменником или адсорбентом, Использование 5 Иизоэлектрофокусировация обеспечивает отделение специфической эндонуклеазы Есо В отспецифической эндонуклеазы ЕсоВ, а такжеот интерферирующих ферментов - неспецифических эндо- и экзонуклеаз. Изоэлектрофокусирование проводится в градиенте плотности,глицерина,.что позволяет опустить обычнуюпри выделении рестриктаз заключительную 19 4стадию стабилизирующего диализа с сохранением активности рестриктазы ЕсоВ в течение года.Целью изобретения является повышение чистоты зцдоцуклеазы ЕсоВ 1,Цель достигается тем, что согласно способу получения сайт-специфической эндонуклеазы ЕсоВ 1, включающему культивирование штамма Е.СоВ У 13, разрушение клеток, очистку фермента, очистку фсрмецта ведут путем хроматографии субстрата на голубой сефарозе с последующим изоэлектрофокусированием при рН 3,510 в градиенте плотности глицерина О, - 60% и отбором фракций прир 1 7,7-8,0.П р и м е р 1. Штамм Е.со 1 В 1 13 выращивдют ца бульоне Хопингсра до начала стационарной фазы. Клетки осаждают центрифугированием. Выход биомассы по сырому весу 30 г/л. Затем клетки суспсндируют в рабочем буфере с рН 7,6, содержащем 0,02 М трис-НС 1, ионы Ми р-меркаптоэтацол, и разрушают на ультразвуковом дезицтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием в течение 1 ч при 105000 1, .Объем недосадочцой жидкости доводят до 100 мл рабочим буфером и наносят на колонку. размером 1,гхго см с голубой сефаразой 4 В (РЬаггпаса), уравновешенную тем же рабочим буфером. Колонку промывают двумя объемами буфера и фермент элюируют линейным градиен. том концентрации МаС 0,1 - 1,0 М, Фракции, содержаигие активность ЕсоВ 1, элюируют 0,35 - 0,6 М чаС 1, объединяют и обессоливают диализом против 0,001 М трис-НС 1 буфера, содержащего 7 мм р.меркаптоэтанол и 0,5%-ный тритон. Полученный материал подвергают изозлектрофокусировацию на колонке с 1 ным амфолином в градиенте плотности глицеринаО -60%.Клетки Е.со 1 В У 13 выращивают в течение 5 ч до стационарной фазы роста, центрифугируют при 5 тыс об/миц, полученную бак; териальную массу разрушают с помощью ультразвукового дезицтегратора. Озвученный экстракг подвергают высокоскоростному центрифугированию при 105000 ч, в течение 90 мин, Недостаточная жидкость представляет собой грубый экстракт, который далее подвергают хроматографии нд голубой сефарозе. Изоэлектрофокусиров ание фракций, содержащих активность ЕсоВ 1, проводят на колонке с амфолинами в диапазоне рН 4,0 - 6,0 в условиях градиента плотности глицерина 60 - 0,1%. Изозлектрофокусирование ведут 16 ч при 600 Ч и затем 48 ч при 1000 Ч. В результате изо" электрофокусирования в таком диапазонетазную активность тестируют с помощьювертикального электрофореза в агарозномгеле, Гель окрашивают раствором этидийбромида в концентрации 3 мкг мл в течение20 мин и фотографируют в ультрафиолетовомсвете при 254 нм с красным светофильтром.За единицу активности принимают минималь.ное количество фермента, необходимое дляполного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбдав течениеч. Всего из 10 г биомассы по. лучено 300000 ед. активности. Пригодность полученного фермента для структурных исследований ДНК и опытов по конструированию 1 и чтго реаомбинантных молекул ДНК опре. деляют следующим образог.Освобождение препарата фермента ЕсоВ 1 от специфической эндонуклеазы ЕсоВ 1 определяют при инкубации полученного фермента с ДНК фага лямбда в среде, оптимальной для проявления ЕсоВ 1-активности. Состав инкубационной срецы: 0,025 М трис НС 1, 0,002 М МС 1, рН 8,5.Отсутствие неспецифических эндонуклеаз опрелеляют при б.ти часовой инкубации репликативной формы ДНК фага Х 74, не имеющей сайта узнаваниядля фермента ЕсоВ 1, с 10-ти кратным избытком препарата фермента, далее анализируют электрофоретичес. кое поведение суперспиральной молекулы ДНК,Отсутствие экзонуклеаз и фосфатвз в препарате фермента определяют по эффективности лигированиялинейной формы плазмиды РВР - 322, полученной в результате действия на кольцевую молекулу этой. ДНК исследуе. мыч ферментом, имеющим оЛин участок. узна. вания на ДНК плазмиды РВ В 322. Лигирова. ние осуществляют с помощью ДНК.лигазы бактериофага Т 4. Препарат рестриктазы ЕсоВ 1, полученный предлагаемым способом, не содержит примесиЕсоВ 1 активности, о чем свидетельствует полное отсутствие фрагментации ДНК фага лямбда в условиях, оптимальных для проявления ЕсоВ активности: в низкой ионной силе при щелочных значениях рН, когда фермент ЕсоЯ 1 не активен. Препарат фермента ЕсоЯ 1 свободен даже от следовых неспецифических эндонуклеаз, о чем можно судить по полному сохранению суперспирализованной структуры репликативной формы ДНК фага Х 174. Отсутствие неспецифических эндонуклеаз и фосфатаз. подтверждается высокоэффективным лигированием линейной молекулы ЛНК РВ 322 после расгцепления ее полученныме ферментом. Правильность восстановления кольцевой формы плазмидной ДНК подтверждается повторным гидролизом рестриктазои ЕсоВ 1 с образованием линейной формы,5 112009 брН 4,2 - 4,5 обнаруживается пик активностиЕсоВ, а пик активности Есо Я 1 отсутствует.П р и м е р 2, Выращивание клеток, раз.рушение клеток, получение грубого экстрактаи фракционирование на голубой сефарозе ведуг по примеру 1. Изоэлектрофокусированиефракций, содержащих активностью ЕсоВ 1, проводят на колонке с амфолинами в диапазонерН 3,5 - 10 в условиях грациента плотностиглицерина 60 - 0,1%, Изоэлектрофокусированиеведут 16 ч при 600 Ч и затем 48 ч при1000 Ч. Активность рестриктазы ЕсоВ 1 присутствует во фракциях 21 - 25 градиента, чтосоответствует изоэлектрической точке белкар 1 7,85. Пик активности ЕсоЯ 1 обнаруживается во фракциях 2 - б, что соответствуетизоэлектрической точке белка р 1 4,35,П р и м е р 3, Выращивание и разруше.ние клеток, получение грубого экстрактаи фракционирование на голубой сефарозе20ведут по примеру 1. Изоэлектрофокусированиефракций, содержащих активность ЕсоВ 1, проводят на колонке с амфолинами в диапазонерН 3,5 - 10 в условиях градиента плотностиглицерина 60 - 0,1% в течение 72 ч при 600 Ч.В градиенте обнаруживаются размытые перекрывающиеся пики . Есо В и ЕсоВ активности,Для стандартной процедуры выделения фермента выбран пример 2. Фермент ЕсоЯ 1,свободный от активности ЕсоЯ 1, обнаруживается в пяти фракциях 8 - 22 градиента вдиапазоне рН 7,0 - 8,0 в присутствии 20% ногоглицерина.Предлагаемый способ характеризуется тем,что изоэлектрофокусирование является единст. 35венным методом, с помощью которого можнополучить рестриктазу ЕсоВ 1, свободную отактивности ЕсоЯ. Предлагаемый способ поз.воляет за б дн. получить концентрированныйфермент ЕсоВ 1с высоким выходом30000 ед, активности на 1 г пасты, Притрадиционном способе получения рестриктазыЕсоЯ из 1 г пасты за 9 - 10 дн. обработкивыделяют 30000. ет. суммарной активностиЕсоВ 1 и ЕсоВ ферментов, Активность45ЕсоВ 1 тестируется во фракциях, содержащих20%-ный глицерин, что позволяет исключитьстадию стабилизирующего диализа. Ферментныйпрепарат хранится при -0 в течение 12 мес.без потери активности.50Активность фермента определяют в инкубационной смеси следующего состава: О, МтрисС буфер рН 7, 4, 10 мм МС1 мм р.меркаптоэтанола,мкг ДНК фагалямбда. Инкубациюведут при 37 С 1 ч. Реакцию останавливают добавлением 5 мкл50% ного глицерина с 00 мм ЭЛТА и0,5%.ного бромфенолового синего. Рестрик112001 Составитель А. МакаровТехред О.Неце Корректор А. Обручар Редактор Н. Джуган Тираж 521 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Заказ 8170 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 7Таким образо 1 ч, предлагаемыйпрепарат фермента может быть использован в эксперименте по генетической инженерии и структур ных исследованиях, Полученный препаратфермента (специфическая эндонуклеаза рестрик. 5 ции Есой) превосходит лучшие образцы зарубежный коммерческих препаратов ферментов данного класса по очистке от рестриктазы ЕсоР,а также по удельной активности и выходу фермента,Таким образом, простота выделения 10 фермента (две стадии фракционирования на колонках вместо 3 - 5 обычных, минуя предварительное высаливание и освобождение отнуклеиновых кислот), уникальная чистотафермснта и высокая удельная активность поз.воляют более и ироко использовать этотфермент как уникальный инструмент в молекулярно-биологических, генно-инженерных иструктурных исследованиях для выделенияиндивидуальных генов, промоторных. областей,маркерных зон; а также для получения рекам.бинантных ДНК.