Способ определения активности с м -зависимой эндонуклеазы лимфоцитов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧ ЕСКРЕСПУБЛИН А 1 И 33/4 СССРСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ инсти- Н СССР в атель скимологииель ский ститут теринарии И.В. Чуп А.К. Газ .И, Встр (088.8) н в,Г(56) Доклады АН М 4, с. 1000-10 (54) СПОСОБ ОПР Са/М 8-ЗАВИСИМОЙ ЦИТОВ СР, 983,ВЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ДОНУКЛЕАЗЫ ЛИМФОа ф Изобретениееской биохими рофиля пик ента по изменен убстрактной ДНК носится к акал и в час ности длности Спри диайкоза кр абилизированную гепарин (10 ед/мин) 1от одного животно" з термостатировану прямого холодильки 200 мм, внутмм) с 0 5 г хлоп 1о ки 9647-И при 37 С. П р и м е р. овь 1 содержащуколичестве 50 ении изменения а эндонуклеазыского лимфоле иост зависимо ке хронич ного рогаЦелью го пропускают чер ную колонку по ти нйка (высота коло ренний диаметр 25 кового волокна ма ого скота. зобретения ительности вляет овьппее споупрощени е чувст соба.Спосо т в выделении лимфом пропускания кровихлопковым волокном сто тов пос дств ки с щий в основном л Элюат содержэритроцэтогобавляют01837 хл рез коло последую фоцитьлизу ты, подвер 50 мл элю 150 мл лед ористогоают олизом, выделении лимфоцитов 1 инку а н еточных р и лоде г ер прикстракклеточных бации выдел рН 8,0-8,3 ции из них горизонталь ннь раствораи через 1бане центпри 4 С.промывают аммонияледяно20 мидваждыса. Выв течение 3-4 ч ДНК 1 ее электро щх блоках агар ин ациири 40оцитоды Хе ореза взных геядамивности Йерифугир статок в 50 м ли сеи с двум Олодцев и ь ным ар еделенни ак ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(21) 4345014/30-3 (22) 17.12.87 (46) 07.02.90, Бюл. (71) Научно-исследо тут медицинской энз и Научно-исследоват экспериментальной в им. Я.Р. Коваленко (72) Н.Н. Ходарев, С.С. Александрова, .Ф. Коромыслов и И (53) 616.155.392.2 2(57) Изобретение относится к аналитической биохимии, в частности для выявления снижения активности Са/М- зависимой эндонуклеазы у животных, больных хроническим лимфолейкозом, Целью изобретения является упрощение, а также повышение чувствительности способа. Лимфоциты периферической крови получают пропусканием образцов через колонки с хлопковым волокном и последующим гемолизом, Выделяют клеточные ядра, инкубируют их при рН 8,0- 8,3 в течение 3-4 ч в присутствии 10 мМ МдС 1 1 и 1 мМ СаС 1 11 экстрагируют ДНК, разделяют электрофорезом в горизонтальных блоках агарозы и активность фермента рассчитывают по изменению пика субстратной ДНК.ход лнмфоцитов в конечном препаратесоставляет более 90% клетокЛимфоциты гемогениэируют в 10 млсреды ТМС,9 (30 ммоль трис-НС 1,рН 8,0; 3 ммоль МяСЛ ; 0,9 моль сахароэы, 0,002 -ный тритон Хвколичестве 0,002 Х) в гомогенизатореЭвельхейма-Поттера, Полученный гомогенат наслаивают на раствор ТМС - 1,2 0(30 ммоль трис-НС 1, рН 8,0; 3 ммольМрСЭ.; 1,2 моль сахарозы) в соотноше -нии 1:3 и центрифугируют 1 О мин,1500-2000 р, при 4 Г,Осадки ядер суспендируют в минимальном объеме ТМС,9 беэ тритонаХ, затем доводят объем ТМС,9до 10-12 мл и суспенэию центрифугируют 1500-2000 я при 4 С 10 мин. Осадки поданным световоймикроскопии представляют собои интактные клеточныеядра, свободные от цитоплаэматических загрязнений, Выход ядер 0,3 мгДНК/10 лимфоцитов,8Для определения активности Са/Мрзависимой зндонуклеазы клеточные ядра суспендируют в инкубационной средеТМСС (50 ммоль трис-НС 1, рН 8,3;10 ммоль МрС:.2, 1 ммоль СаС 1;0,25 моль сахарозы) до концентрации1 мг/мл по ДНК, В инкубационные пробирки (.Эппендорф) вносят 10-50 мклсуспензии ядер в ТМСС. Инкубацию проводят при 37 С в течение 4 ч на термостатируемом 1 пейкере. По окончанииинкубации в каждую пробу вносят равный объем 2 М 11 аС 1 и 0,1 объема 1 О ного додецилсульфата натрия, послечего добавляют протеиназу К до конечной .концентрации 100 мкг/мп и инкубируют 30 мин для протеолиэа иосвобождения ДНК иэ ДНК - белковыхкомплексов, После этого к пробам добавляют равный объем смеси хлороформа с иэоамиловым спиртом (24:1) и 45встряхивают 20 мин на шейкере. Пробыцентрифугируют лри 3000 р 10-15 мин,переносят водную (верхнюю) Фазу, содержащую ДНК, в чистые микропробирки,после чего к образцам добавляют1,5 объема 50 ,-ного глицерина, содержащего 2,5% бромфенолового синего.Для проведения электрофореэа ДНК готовят горизонтальные блоки агарозы(2%) в стандартном трис-ацетатномбуфере. Размер блоков 17(20-24) см.55В блоках формируют два ряда гнезд,дпя чего вставляют в форму параллельно дру дру у на расстоянии 10 см"гребенки" с 20-25 зубчиками, в каждый канал вносят пробы, содержащие5 мкг ДНК, Электрофореэ проводят принапряжении 50 В и максимальном токев течение одного часа. Гель окрашивают бромистым этидием (1 мкг/мл ) иФотографируют, освещая двумя ультрахемископами с длиной волны 254 нм,расположенными с обеих сторон геляпараллельно направлению каналов суглами наклона к поверхности геля 45.Полученные негативы сканируют наданситометре "Хромоскан", Денситограммы представляют распределениеДНК, выделенной иэ клеточных ядер,Пики соответствуют субстратной (хромосомной) ДНК неинкубированных и инкубированных 3 ч ядер. На высоте2/3 амплитуды измеряют ширину пика(В) и относят ее к 1/3 амплитуды ( Р).Величину В/Р обозначают как Ап длянеинкубированных ядер и Адля ядер,инкубированных в течение 3 ч. Активность определяют ло формулеА ь - АоА =-- А 00 .АоЗа единицу активности принимаюттакое количество Фермента, котороеобеспечивает за 3 ч инкубации клеточных ядер в концентрации 1 мг/мл всреде с 10 ммоль МрС 1, 1 ммоль ГаС 1при рН 8,0-8,5 изменение величины Ана 0,01 по сравнению с интактными(неинкубированными) ядрами,Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить активностьСА/МЕ;-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов крови.Формула изобретенияСпособ определения активностиСа/Мр-зависимой эндонуклеазы лимфоцитов путем выделения из лимфоцитовклеточных ядер в присутствии сахарозы и тритона Х=100, инкубации ядерв растворах, содержащих 1 мМ СаС 1,10 мМ МОСХ, экстракции и последующего электрофореэа ядерной ДНК в блокахгеля агарозы, расчета активностиСа/Мд-зависимой эндонуклеазы лимфоцитов, о т л и ч а ю щ и й с я темф1что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, ядра инкубируют при рН 8,0-8,3 в течение3-4 ч, а электрофореэ ядерной ДНКпроводят в горизонтальных блоках гелей агарозы,