Способ получения тирозини серинсодержащих пептидов

,э у, %"рганического а Трудового Красногсинтеза АН Латвийско 71) Заявите О ЗнамениССР тут 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИРОЗИН - И СЕРИНСОДЕРЖАЩ ПЕПТИДОВ 2 щи е Изобретение относится к улучшенному способу получения тироэин. и серинсодержащих пептидов, которые могут найти применение как полупродукты при синтетическом получении адренокортикотропина и его аналогов.Известен способ синтеза АКТГ 4 методом ступенчатого наращивания цепи с й.конца с использованием трифенилфосфита и имидазо. ла в качестве конденсирующего агента, при этом гидроксилы тнрозина и серина защища ют бензильными группами 1,Недостатком этого способа является не. обхопимость защиты ОН группы тирозина и серила, Соответствующие о.бензилпроиэводные тироэина и серина являются труднодо. ступными соединениями. Их применение связано с применением натрия в жидком аммиаке и другими осложнениями. В то же время при отщеплснии бензильиой группы от тироэина жидким фтористым водородом, что применяется при тотальном снятии защитных групп с АКТГ и его аналогов, происходит миграция бенэильной группы в тертьее положение фенильного остатка тирозина 23. Известен аэидный метод ступенчатого наравания пептидной цепи с й-конца азидным четанием двух дипептидов или комбинация идного метода скарбодиимидным 3 и 41.Применение азидного метода для синтеза птидов с аминокислотной последовательностью КТГ 1 4 дает возможность вводить тироэин и рин в пептидную цепь с незащищенными гидроксильными группами, однако наблюдаетбольшое число лобочных реакций, что сниет качество целевого продукта. Наиболее близким к предлагаемому является способ получения серии- и тирозиноодержащих пептидов путем последовательного наращивания пепткдной цепи с С-конца конденсацией защищенных по аминогруппе остатков тирозина и серила с защищенным аминокислотным компонентом в присутствии в. качестве конденсирующего агента й, й-дициклогексилкарбодиимида в ацетонитриле при ох. лаждении, с использованием для зашиты не вступающих в реакцию аминокислотных остат.ков бутипоксикарбонильных групп (ВОС) %.93744 3Недостатком этого метода является то, что Й,Й-дициклогексилкарбодиимид сильный аллерген и работа с ним требует особых мер предосторожности, %что усложняет использование этого метода в укрупненных масштабах. Кроме того, присоединение ВОСсерина и ВОС-тироэииа проводят в растворе ацетонит. рила или смеси ацетонитрилдиметилформамид, Для отщепления защитных ВОС.групп исполь. зуют трифторуксусную кислоту или раствор 1 п избыточного количества хлористого водорода в уксусной кислоте при комнатной температуре в течение 15 мин.Цель изобретения - упрощение процесса, улучшение условий труда, повышение качества и расширение ассортимента целевых продуктов, которые могут быть использованы в синтезе адренокортикотропного гормона,Поставленная цель достигается способом получения тироэин- и серинсодержащих. пептидов общей формулы Е - У - Туг - Зег - Х - ОЕ,где Х - Мет, й 1 ец",У - Заг; 13 - Аа, Зег 2.,0 аег;Е - метил или этил;Е - бензилоксикарбонил,путем последовательного наращивания пептидной цепи с С-конца конденсацией защпценных по аминогруппе остатков тиро;Йна и серина с защищенным аминокислотным компонентом в присутствии в качестве конденсирующего средства 1-этоксикарбонил.этокси,2-дигидрохинолина, с последующим снятием защитных групп обработкой хлористым35водородом при комнатной температуре.Про.цесс наращивания пептидной цепи проводятв растворе хлористого,метилена при комнатной температуре. для защиты аминокислотных остатков тироэина и серина используют40О -нитрофенилсульфенильную группу, снятиеО.нитрофенилсульфенильной защиты проводят раствором эквивалентного количества хлористого водорода в этаиоле в течение 2 - 5 мин.Осуществление предлагаемого способа позво. 4 фляет использовать незащищенные по гидроксилу серии и тирозин при полном отсутствиипобочных реакций по этим группам. Дляочистки промежуточных продуктов не требуется ни перекристаллизация, ни хроматография. 0Образующиеся побочные продукты удаляютсяэкстракцией,Органические растворители упаривают нароторном испарителе нри остаточном давле-.нии 12 - 15 мм рт. ст. и температуре 30 - М40 С. Температуру плавления (разложения)определяют в открытых капиллярах безкоррекции, углы вращения - на поляримет. 7 4ре фирмы "Перкин-Элмер" (модель 141).Электрофоретический анализ проводят на бу.маге "Фильтрак-ФН 16" (ГДР) в 30%-нойуксусной кислоте (рН 1,9) при потенциальном градиенте 18 В/см в течение 1,5 ч.Электрофоретическая подвижность соединения(Е 111 ) определена по отношению к гистидину. Хроматографическая подвижность определена на пластинках "Силуфолте (Чехословакия) в системах: н-бутанол-уксуснаякислота. вода (4:1:1), бензол-этилацетат-мета.нол (6:2:1) и бенэол-ацетон (2:1),Проявление электрофореграмм проводятнингидрином, пятна на хроматограммах обнаруживают нингидрином, реактивами РейнделаХоппе, Паули и в УФ-свете при 254 нм,Образцы для элементного анализа высушивают в течение 10 ч в вакуумном эксикаторе над пятиокисью фосфора и гидро.окисью калия,П р и м е р 1. Метиловый эфир о.-нитрофенилсульфенил-серил-метионина (1),К суспензии 24,1 г (55 ммоль) дициклогексиламмониевой соли о-нитрофенилсульфенилсерина в 350 мл хлористого метилена прибавляют 10,0 г (55 ммоль) гидрохлорида метилового эфира метионина и перемешивают прикомнатной температуре 15 мин. Прибавляют13,6 г (55 моль) 1-этоксикарбонил -2-этокси,2 дигидрохинолина и реакционную смесьоставляют на ночь. Отфильтровывают осадокгидрохлорида дициклогексиламина и растворитель упаривают. Остаток растворяют в 450 млэтилацетата, промывают 5%.ным растворомйаНС 02 (4 х 50 мл), 10%-ным растворомКНЗОф (4 х 50 мл) и водой (2 х 50 мл).Упаривают и остаток сушат азеотропной отгонкой с бензолом (50 мл), Кристаллизуют изпетролейного эфира, фильтруют и получают 19,5(94,6%) желтого тещищенного Липептиие Я),т.пл. 91 - 97 С. й = 0,42, В = 0,47, а-50,6 (с 1, диметилформамид) .Вычислено, %: С 44,65; Н 5,25 й 10,41.С 1582106 йз З 2Найдено, %; С 44, 73; Н 5,26; й 10,20,П р и м е р 2. Гидрохлорид метиловогоэфира серил-метионина (Н),К раствору 6,05 г (15 ммоль) эащищенно.го дипептидав 200 мл абсолютного этанола прибавляют 10 мл 1,5 раствора хлористоговодорода в абсолютном этаноле и выдерживают при комнатней температуре 2 - 5 мин,Растворитель уаривают и остаток встряхивают с 300 мл воды и 50 мл этилацетата, Этил.ацетатный слой отбрасывают и водный слойпромывают эпщацетатом (5 х 50 мл), Вод.ный раствор перемешивают с активированнымуглем при комнапюй температуре 2 ч и фильт.,руют, Упаривают воду досуха и полученный5свободный дипептид (И) без дальнейшей крис. таллизации используют на следующей стадииСу = 047 ЕН 1 в 082П р и м е р 3, Метиловый эфир о-нитрофенилсульфенилтирозил-серия.метионмна (И) .Получен аналогично защвценному дипептиду(пример 1) из дицмклогексиламмоииевой соли о-нитрофеннлсульфенилтирозина и гидрохлорида дипептида (И). Продукт представляет собой желтое аморфное вещество. Выход 85%, тпл 78 - 88 С йо= 043; ВС = 034 а 1 -ЯЬ = + 34,4 (с 1, дмметилформамид).Вычислено, %: С 50,87; Н 5,33; Й 11,31,С 24 НЗОйй 4 Ов з 2Найдено, %; С 52,27; Н 5,33; й 11,26.П р и м е р 4. Гидрохлорид метилового эфира тироэил-серил-метионина (Ч) .Снятие защитной группы с защищенного трипептида (И ) проводят аналогично снятию с защищенного дмпептнда(пример 2). Гидрохлорид трипептида (Ч) представляет собой аморфное гигроскопическое вещество 81 = 0,55. Ен,у 0,68.П р и м е р 5. Метиловый эфир карбобензокси-р.алании-тирозил-серия-метионина (Ча).0,89 г (2,2 ммоль) дмциклогексиламмонневой соли карбобензокси+аланина и 0,93 г (2,06 ммоль) гидрохлорида трнпептида (Ч) в 20 мл хлористого метилена перемешивают при комнатной температуре 15 мин. Прибавляют 0,54 г (2,2 ммоль) 1-этоксикарбоннл 2-этоксн,2-дигидрохинолина и оставляют на ночь, Отфильтровывают осадок гидро. хлормда дмциклогекснламина, растворитель упаривают и остаток растворяют в 100 мл ибутанола. Промывают 5%.ным раствором йаНСОз (2 х 50 мл), 10%.ным раствором КНЯОв (2 х 50 мл) и водой (2 х 50 мл). Органический слой упаривают и остаток обрабатывают диэтиловым эфиром. Фильтруют и получают 1,14 г (90,0%) защищенного тетрапептида ( Чц ). Т, пл. 102-110 С. Й = 0,76. К=0,37, а 1 :-15,5 . (са 61, диметилформамнд) .Вычислено, %: С 56,29; Н 6,19; й 9,05,С 29 Нззй 4 О 198Найдено, %: С 56,28; Н 6,13, й 9,57.П р и м е р 6. Метровый эфир карбобенэокси- .-сернл тироэнл.серилметионина (ЧЬ),К раствору 4,5 г (10 ммоль) гидрохло. рида трипептида (Ч) в 100 мл хлористого метилена прибавляют 2,1 мл триэтиламина и 2,4 г (10 ммоль) карбобензокси- серина. Перемешивают при комнатной температуре 15 мин, прибавляют 2,5 г (10 ммоль) 1этоксикарбонил. этоксм,2-дигидрохинолин и оставляют на ночь. Гелеобразную реакционную смесь упаривают и остаток обрабатывают 150 мл этилацетата. Фильтруют и оса 937447 6док на фильтре промывают несколько разконцентрированными растворами йаНСОКН 804 и водой. Осадок растворяют в мини.мальном количестве этанола, разбавляют во 5 дой и насьпцают хлористым натрием, Фильт.руют осадок, тщательно промывают нафильтре водой. Получают 5,1 г (80,5%) эа.щищенного тетрапептида ( Ч 6 ) т.пл, 163 -167 С, й = 0,96, ВФ = 0,32, а 546 =зо - - 17,0 (с 1, диметилформаммд),Вычислено, %: .С 54,87; й 8,82; Н 6,03,Сз 9 Нзвй 401 ойНайдено, %: С.55,33; й 8,27; Н 6,13.П р и м е р 7. Метиловый эфир карбо.15 бензоксм-О-серия-тирозил-серилметионмна (Чв)Получен аналогично тетрапептиду ( Ч 8 )(пример 6) из карбобензокси-О.серина и .трипептида ( т ). выход 63,4%, т.шт. 128 -132 С) Ву = 0,96, й =0,32, а " -7,44 Ь0 (с 1, диметнлформамид),Вычислено, %: С 54,87; Н 6,03; й 8,82,Сг 9 Нз вй 101 о 8Найдено, %: С 55,17; Н 6,01; й 8,97.П р и м е р 8, Гидрохлорид этиловогоэфира норлейцина (Ч),К 50 мл абсолютного этанола при -10 Си интенсивном перемешнвании прмбавляютпо каплям 18,3 мл (250 ммоль) хлористо.го тионнла. Поднимают температуры доЭО комнатной и прибавляют 30 г (227 ммоль)норлг пина; Полученную суспензию переме.шивают при комнатной температуре 6 чн прибавляют 350 мл смеси петролейного идмэтилового эфиров (1:). Выпавший осаЗЗ док фильтруют и промывают на фильтреэтой же смесью (Зх 50 мл), Выход 444 г= 0,47, Е,.:0,94. а 3 = +. 17,9 С (с ,этанол).40 Вычислено, %: С 49,90; Н 9,27; й 7,11СвНвбзСНайдено, %: С 49,46; Н 9,34; й 7,33,П р и м е р 9. Этиловый эфмр о.нитрофенилсульфенило-сермл-норлейцина (ЧИ) .Получен аналогично защищенному дмпепти.ду(нример 1) из дмциклогексиламмоимевой соли о-нитрофенилсульфенилсеринаи гидрохлорида этилового эфира норлеицииа.Выход 90,4%, т.пл. 124 - 125, й 0,59;йу щ 0,52. Ы- - -77,0 (с 1, этанол).Вычислено, %: С 51,12; Н 6,31; й 10,52,Сз 7 йззйзОввНайдено, %: С 52,00; Н 6,21; й 10,77.П р и м е р 10. Гидрохлорид этилово.го эфира сермя.иорлейцина (ЧИ),Защитную группу с НФС.дипептида (ЧИ)снимают.по описанному методу (нример 2).Выход количественный, т,пл. 114-115 С.937447 Формула изобретения Составитейь В, ВолковаТехред Ж, Кастелевич Корректор Н, Швыдкая Редактор Н. Рогулич Заказ 4370/31 Тираж 445 ПодписноеВНИИПИ Государственною комитета СССРпо делам изобретений и открытий3035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ИПП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 7Ят 0,69, Е ф 0,81, а 9,7 (с 1, эта.иол).Вычислено, %: С 46,72; Н 8,20; й 9,91,С,ННайдено, %: С 46,77; Н 8,17; й 9,84.П р и м е р 11,Этиловыи эфир о.нитрофенилсульфенил-тирозил.серил-норлейцина(1 Х),Получен аналогично защищенному дипепти.ду 1 иэ дициклогексиламмониевой соли о нитрофенилсульфенилтирозина и гидрохлорида трипептида (Ч 111) свыходом 9%, Т.пл,73 С с разложением Я = 0,47, Я = 0,40,афц-+ 65,8 (с 1, этанол).Вйчислено, %: С 55,63; Н 6,09, й 9,96,СабН 848 йа 08Найдено, %: С 56,12; Н 6,03; й 10,12,П р и м е р 12. Гидрохлорид этиловогоэфира тирозил.серил-норлейцина (Х),Защитную группу с трипептида (1 Ч) сни.мают по описанному методу (пример 2,.Выход 91%, т,пл. 145 С с разложением, Я =(Х 1) .Получают аналогично защищенному тетрапептиду (Чб) (пример 6), Вход 82,5%,.т.пл. 123 С с разложением, Я = 0,48.а - 0,5 (с 1, диметилформамид),Йычислено, %: С 60,57; Н 6,89; й 9,11.9Сз 1 Н 4 айа 09Найдено, %: С 60,72", Н 7,19; й 9,31. Способ получения тирозин- и серинсодержащих пептидов общей формулыЕ - У - Туг - .Бег-Х-ОЕ,где Х - Мет, йеО;У - 8 аг;- Аа;8 ег, 08 вг;Е - метил или этил;Е бензилоксикарбонил,путем .последовательного наращивания пептид-ной цепи с С-конца конденсацией защищенных по аминогруппе остатков тироэина 1серина с защищенным аминокислотным ком 5 понентом в присутствии конденсирующегосредства, с последующим снятием защитныхгррш обработкой хлористым водородом,при комнатной температуре, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощенияпроцесса, улучшения условий труда, новышения качества и расширения ассортиментацелевых продуктов, в качестве конденсирую.щего средства используют 1 этоксикарбонил.2-этокси.1,2-дигидрохинолин, процесс наращивания пептидной цепи проводят в растворе хлористого метилена при комнатнойтемпературе, для эициты амииокислотныхостатков тирозина и серина используют о.-нитрофенилсульфенильную группу, снятие20о.нитрофенилсульфенильиой защиты проводят раствором эквивалентного количества.хлористого водорода в этаноле в течение2 - 5 мин,25 Источники ин о ма ф р цнн,принятые во внимание при экспертизе1. Гудков А. Г, и др. Синтез амида октадекапептида (1 - 18) 1-кортикотропина сиспользованием трифенилфосфита и имидазо.ла.Синтез декапептида (1 - 10) 1-кортико.тропина, Де 7534 - 73, РЖ "Биофизика",1974, У 4,2. ВгОсе Егс 1 сзоп В МеггИед Я,В,Асд МаЬМу оФ зечега Вепшс Рго 1 естпц.35ЦГООрз Озбд и 80 И-ревазе Рейде зупФез 8/геаггапяегпепт оХ о - Вепгуйугозпе - . Аеег.СЬет, 8 ос. 1973, 95, У 1, с. 3750.3, Патент ФРГ Нф 2114300, кл. С 07 С 103/52,опублик. 1973,4, Шредер Э., Любке К. Пептиды. Ч. 1.М., "Мир", 1967, с. 116,5. Патент Швейцарии У 497384,кл, С 07 С 103/52, опублик, 1970 (прото.тип),