Реактив для определения фосфатаз

(32) Приоритет 14.11,66 (31) 59374031.03.67 627430 (33) США оаударатеа:ньй комитет ьоаета Ьиииотроз СССР аа денем изобретенийн отиоцтий Опубликовано 25.09.74, Бюллетень35(088.8) Дата опубликования описания 24.09.75(72) Авторы изобретения Иностранцы Даниель Гарольд Дойч, Джон Дуглас Муррей, Стенли Эдвард Грин,Эдвард Вабе Салеби и Богдан Мирослав Стесив(США) Иностранная фирма Смит Клайн энд Френч Лабораториз(54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФАТАЗ Предлагается реактив для оонарутксция и количественного определения щелочных и кислотных фосфатаз в биологических жидкостях, например в сыворотке.Известен реактив для анализа фосфатаз, который включаег субстрат - двунатрисвую соль и-цитрофенилфосфорной кислоты, сухой буфер для поддержания рН 4 - 11 и активатор - соль магния, Эта соль в сухом состоянии нестабильна и получение ее затруднено. Кроме того, чувствительность известного реактива недостаточна, особенно при определении щелочных фосфатаз. С целью повышения стабильности реактиваи чувствительности анализа, предлагается реактив, в который в качестве суострата введена аминная соль п-нитрофенилфосфорной кислоты,Желательно в качествс суострата использовать соль трис-(оксиметил) аминометана и и-цитрофенилфосфорной кислоты- .или соль дициклогексиламина и г-нитрофенилфосфорной кислоты. Целесообразно также в состав реактива добавлять маннит.Сухой порошкообразцый реактив содержитаминную соль г-нитрофенилфосфорной кислоты, буфер (карбонат щелочного металла, например карбонат натрия и бикарбонат натрия), металлсодержащий активатор, предпочтительно глютамат магния или магниевуюсоль аспаргиновой кислоты, и маннцт.Обычно в зависимости от того, какую фосфатазу определяют, кислую плц щелочную, рН5 поддерживают в пределах 4 - 11, соответствующим образом выбирая один плц несколькоизвестных буферов,В сухом виде этот порошок стабилен и может долго сохраняться. Он может быть разде 10 лен на отдельные небольшие порции для образовацця водного раствора, пригодного дляпроведения одного ацалцза сыворотки. Каждую цз этих порций можно затем расфасовывать в виде таблеток цли капсул.15 Указанные субстраты в сухом виде болеестабильны, чем двунатрцевая соль и-нцтрофенплфосфорной кислоты, Манпит также увеличивает стабильность субстрата, Кроме того, онактивен в энзцматической реакции. Количество20 добавляемого мацнита можно изменять в широких пределах, так как положительное влияние маннита прпблцзцтельно пропорционально его количеству, Верхним пределом, по-видимому, является растворимость этого инди 25 видуального вещества в воде прц температуре проведения испытания, т. е. около 37 С,Точными экспериментами было установлено,что заметные результаты можно получить приконцентрации дооавки несколько мцллцграм 30 мов на 1 мл растворенного в воде аналитиче444376 П р и м е р 1, Определение активности солейи-нитрофенилфосфорной кислоты (и-НФФК).Компоненты реактива.Буфер (рН 10,2). Растворяют 8 г Ха,СОэ5 2 г КаНСО, и 300 мг глютамата магния в1 л воды.Анормальная клиническая химическая кон.трольная сыворотка Хиланда,0,03 М растворы аминных солей и-НФФК,10 0,03 М раствор двунагриевой соли п-НФФК(в качестве контрольного).Расчет.Скорость реакции аминной соли п-НФФК, О/,:ЬА 4/мнн (амин) Х 10015 ЛАЙ/мнн (М 82) Свободный п-нитрофенол (вес. ц/с) определяютпри 405 мамк.Свободный п-нитрофенол =20А 4 щ (для пробы)А 4 оь (для стандарта) В табл. 1 приведена энзиматическая активность аминных солей. Таблица 1 Свободныйп-нитрофенол, вес, о,4 Соль Скорость, ,г Дннатрнй л-Нфф Динатрнй л-НФФ Метиламин и-НФФ Днметиламин л-НФФТрнметиламин п-НффМоноэтаноламин и-НффМорфолнн л-НффМонобензиламин и-НФФфурфурнламин п-НффАнилин п-Нффтрис-(Окснметил) аминометан л-Нффтрис-(Окснметил) амннометан л-Нфф (сухой)Днциклогекснламин п-Нфф полного растворения, го твердый осадок удаляют).В кювету отбирают пипеткой 0,05 мл образца и добавляют 2,5 мл буферного раствора (рН 10,2). Определяют светопоглощение при 30 405 ммк на любом подходящем спектрофотомегре,Расчет.Свободный п-нитрофенол (вес. /, ) == А 4 оьХ 0,228.35 В табл. 2 приведены результаты определения свободного п-нитрофенола после обработки реагента фосфатазой,ского реактива. Пределы конструкции маннита составляют 25 - 180 мг на 1 мл разбавленного водой реактива,Реактив можно растворять в стандартном количестве воды и смешивать затем его с биологической пробой для проведения энзиматической реакции. Количество субстрата, содержащегося в реактиве, должно быть достаточным для того, чтобы реакция происходила с постоянной скоростью. В результате определяют количество или величину активности неизвестного фермента.Аминные соли п-нитрофенилфосфорной кислоты (и-НФФ) могут быть получены реакцией соответствующего амина с солью щелочного металла и-нитрофенилфосфо 1 рной кислоты. Эти соли могут быть осаждены концентрированием или же добавлением органического растворителя. Кроме того, свободную п-нитрофенилфосфорную кислоту можно нейтрализовать соответствующим амином в растворе и осадить соль добавлением органического растворителя или упариванием до начала кристаллизации, затем соль отделяют, промывают и сушат.Перед добавлением сыворотки. Определение образования п-нитрофенола из солей п-НФФК при различных внешних условиях,Методика. Взвешивают 3 пробы каждой соли по 100 мг. Помещают первую пробу каждой соли п-НФФК в сухой эисикатор, кладут вторую пробу в эксикатор с насыщенным раствором сульфата аммония для выдерживания ее при постоянной влажности, третью пробу выдерживают при комнатных условиях.Выдерживают все образцы в этих условиях по крайней мере в течение 48 час, Растворяют каждую пробу в 5 мл воды (свободный и-нитрофенол растворяется в 5 мл воды, если нет 100 104 107 105 84 98 86 50 66 96 91 81104 0,04 0,07 0,08 0,09 0,10 0,05 0,12 0,06 0,04 0,04 0,03 0,04 0,04холостой Динатрий л-Нфф Этиламин и-Нфф 0,010 0,009 0,014 0,006 0,004 0,007 0,016 0,035 0,010 0,016 0,005 Метиламин и-Нфф Диметиламин и-НффТриметиламин л-НффМоноэтаноламин и-Нфф 0,04 Не анализировали 0,007 0,04 0,04 0,02 0,03 0,03 о Растворим не полностью. П р и м е р 2. Методика определения щелочной фосфатазы.Реактивы.Раствор А. В 100 мл дистиллированной воды растворяют следующие вещества, мг:ИаСОз 850 ХаНСО, 250 Магниевая соль аспарагиновой кислоты 50Ди- (циклогексиламмонийная) соль и-НФФ 315 Б (концентрация маннита в реатенте равна 0 мг/мл).Реагент 3:2 мл раствора А+1 мл раствораБ (концентрация маннита в реагенте равна 5 33 мг/мл).Реагент 4:0 мл раствора А+3 мл раствораБ (концентрация манннта в реагенте равна 100 мг/мл).Реагенты помещают в кюветы, выдержива ют в течение 10 мин при 37 С, после чего определяют и записывают оптическую плотность при 415 ммк.Энзиматическую реакцию инициируют добавлением 20 Х анормальной сыворотки Хи ланда (серийный номер 368 А 16).Показания снимают спустя 10 мин послетого, как реагент смешали с сывороткой (Аи) и через 15 мин (А 15). Результаты приведены в табл. 3. Раствор Б. В 10 мл свежеприготовленного раствора растворяют 1000 мг маннита.Растворы А и Б смешивают вместе для получения четырех аналитических реагентов, как описано ниже.Реагент 1: 3 мл дистиллированной воды.Реагент 2:3 мл раствора А+О мл раствора Т аб липа 3 Увеличение скорости по сравнению с опытом 2, %Опыт Ао Вычислено Ац А 1 о Ь,мин 0,051 0,051 0,051 279 355 473 0,480 0,560 0,652 0,033 0,042 0,056 0,645 0,772 0,932 27 70 Морфолин л-НффМонЬбензиламин и-Нфф+фурфуриламин и-Нфф+Акилин л-Нфф+трис-(Оксиметил) аминометана-Нфф трис-(Оксиметил) аминометани-Нфф (сухой)Циклогексиламин л-Нффф 0,04 0,07 0,09 0,07 0,15 0,05 0,13 0,06 0,04 0,05 0,02 0,28 0,07 0,10 0,11 0,14 0,04 0,11 0,05 0,04 0,04 0,02 0,04 0,07 0,09 0,20 0,11 0,05 0,15 0,05 0,04 0,04 0,02444376 Таким образом,В оптической кювете растворяют одну таблетку (или капсулу), содержащую указанные ингредиенты, в 3,0 мл воды, добавляют 20 ге анализируемого образца сыворотки. Как только реагент и образец перемешаются, происходит следующая реакция:рн 8 101 буфер)Лминная соль+ Щелочная -+и-НФФ фосфатаза А,; - А 1 у5 (мин) 10 рн 8 10 (буфер)--- Нитрофенол+ Соль фосфорнойкислоты. Кювету выдерживают при 37 С и измеряют 15 скорость изменения оптической плотности втечение 10 мин. 1 ак как это - скорость реакции, температура и определяемые интервалы должны быть точно соблюдены,общий объем 1000 17,7 лл сыворотки А 415 ммк (при 5 мин) 20 5 мин 1. Реактив для определения фосфатаз,включающий субстрат - соль и-нитрофенилфосфорной кислоты, - сухой буфер для поддержания рН 4 - 11 и активатор - соль магния, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышениястабильности реактива и чувствительностианализа, в качестве субстрата использованаЗ 0 аминная соль п-нитрофенилфосфорной кислоты.2. Реактив по п. 1, отл и ч а ю щи й с я тем,что в качестве субстрата применена соль трис(оксиметил) аминометана и и-нитрофенилфосфорнои кислоты.3. Реактив по п. 1, отличающийся тем,что в качестве субстрата использована сольдициклогексилампна и п-нитрофенилфосфорной кислоты,40 4. Реактив по п. 1, отличающийся тем,что в его состав введен маннит. б 002830 250 Приоритет 14.11.бб установлен по пп, 1,2 и 3;приоритет 31.03,б 7 - по п. 4,Составитель С. Зуммеров Тскрсд Т. КурилкоКорректор Е, Рогайлина Редактор О. Кузнецова Заказ 2599,1 Изд. ов 575 ЦНИИПИ Государственного комитета по делам изобретений и Москва, Ж, РаушскаяТипография, пр. Сапунова, 2 ф) Эту серию сыворотки предварительно калибруют хорошо известнымп методами для определения соответствующего числа Меукдупародных единиц (М. Е.) следующим образом. Оптическая плотность раствора п-нитрофепола с концентрацией 1 мкмоль/мл равна 17,7, А 418 - оптическая плотность при длине волны 41 ммк. М. Е./л сыворотки: ЬА 4 ммк х А ммк (при 10 мин)ммк мин:5 мин Общий объем = 3,0 мл.Количество сыворотки =0,020 мл (201).Расчет. М.Е,/л сыворотки: - ЬА 4, ммк/мин )(3,0 100017,7 0,020 М. Е./л сыворотки - 8450,Для изготовления реактива сухие ингредиенты смешивают и смесь таблетируют или капсулируют известными методами. Состав таблетки реактива для 3 мл щелочной фосфатазы:ХагСОз, мл 850 Магниевая соль аспарагиновой кислоты, мг 50трис-(Оксиметил) аминометан п-НФФ, мгМаннит, мгКарбовакс 4000, мг Предмет изобретения Тираж 474 ПодписноеСовета Министров СССРоткрытийнаб., д. 4/5