Способ получения фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего проинсулин человека

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 4 С 2 Х 5 О СУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИИ ПНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АТЕНТУ(71) Дзе а Бюл, М 24нтс Оф Дзе Юнив,577,2(088.8)ес.а 1.8 с 1 епсе 1 Ридж рния Бел рсити оф Калифо (72) Грем Говард М и Вильям (53) 575 (56) 111 г 1977, р,тет айкл Дж. 224, 6,сЬ313 ЮССО.ами-,Изобретение относится к области генэтической инженерии и касается получения фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего проинсулин человека с помощью рекомбинантной ДНК-технологии.фрагмент ДНК, кодирующий проинсулин, получают путем клонирования гена млекопитающего. После клонирования в плаэмиде рВВ 322 выделяют его с помощью эндонуклеаэ НЬа 1 и А 1 ц 1 и модифируют присоединяя химически синтезированную нуклеотидную последовательность 3-ТТТСТСААССААСАССТСТСССС СТСАСАССТССААС, кодирующую 14 аминокислот проинсулина.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАГМЕНТА НУКЛЕИНОВ 01 КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА(57) Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего проинсулин человека с помощью рекомбинантной ДНК-технологии, Фрагмент ДНК, кодирующий проинсулин, получают путем клонирования гена млекопитающего. После клонирования в плазмиде рВК 322 его выдепя" ют с помощью эндонуклеаз НЬа 1 и А 1 о 1 нли эндонуклеаз НЬа 1 и модифицируют, присоединяя химически синтезированную нуклеотиднчо послеаова тельность 3 -ТТТСТСААССААСАССТСТС СТСАСАССТССААС, кодирующую 14 нокислот проинсулина. П р и м е р 1, РНК получают иэчеловеческой инсулиномы после центрифугировання в 5,7 М СзС 1, содержащем100 мМ ЭДТУ, и используют беэ дальнейшего фракционирования в качествешаблона для синтеза кДНК с использо"ванием обратной транскриптаэы и 81 нуклеазы, Приблизительно 40 нг двухнитевой кДНК получают из 130 мкгнефракционированной РНК,Нефракционированную кДНК обрабатывают концевой трансферазой в присутствии дЦТФ для получения олиго-Схвостов на 3-концах молекул кДНК,Плазмиду рВК 322 расщепляют эндонуклеазой ограничения РзС 1 и обраба"10 тывают концевой трансферазой в присутствии ОСТР для получения олнго 1ЙС-хвостов на 3 -концах линейнойплазмидной ДНК.Сшивают полученные фрагменты иполучают кольцевую плазмиду,Штамм Е.со 1 д Х 1776 трансформируютс использованием плазмидных ДНК-содержащих вставокПолучают 525 резистентных к тетрациклину трансформантов. Их реплицируют высевом и классифицируют на инсулиновые последовательности с помощью гибридизации колоний (дп зтц), Ранее клонированнуюкДНК препроинсулина крыс используютв качестве пробы для гибридизации,после метки кДНК крыс - с помощьюКс 1-трансляции с применением ДНК-полимеразы 1 Поскольку аминокислотныепоследовательности инсулинов крыс ичеловека довольно сходны (инсулин,927. гомлогия; проинсулин, 837. гомлогия), предполагают, что клонированная, кДНК крыс будет испытывать кросс-гибВридизацию с последовательностями человеческого инсулина в нежестких условиях. Авторадиографией выявляют,что две из 525 колоний гибридизированы с пробой клонированного препроинсулинакрыс. Обе колонии чувствительны к ампициллину, Выделенныеиэ колоний плазмиды приблизительнона 250 пар оснований (Ьр) и на 500 Ьрдлиннее, чем сам рВК 322. Более длинную плазмиду обозначают как рсН 1-1.Нуклеотидную последовательностьвставленного кДНК фрагмента рсН 1-1определяют методом Махаш апй С 1 Ъег.П р и м е р 2, нДНК вставка рсН 1-1содержит полную кодирующую последовательность для человеческого препроинсулина,ДНК синтетического проинсулинаобрабатывают А 1 ц-эндонуклеазой дляполучения двух фрагментов размером43 Ър и 56 Ьр, Аналогично кДНК-вставку рсН 1-1, предпочтительно полученную с помощью обработки НЬ а 1, расщепляют частичным гидролизом, каталиэируемым А 1 ц-эндонуклеазой с образованием фрагментов по 75, 90, 110,135, 165, 200, 245, 275, 375 и 455 Ърсоответственно их фракционируют методом гельэлектрофореза с получением фрагмента 375 Ър, который получается в, результате разрыва в одном местоположении в кодоне для аминокислоты М 14. 15 20 25 30 35 40 45 50 фрагменты расщепления синтетического гена и фрагмент 375 Ьр соединяют с помощью тупоконечной лигатуры, Точное соединение синтетического фрагмента размером 43 Ьр с 375 Ьр кДНК-фрагмента максимизируют при условии, что 375 Ьр кДНК присутствует в молярном избытке. Возможности для неточного соединения также минимизируют тем, что синтетические фрагменты имеют однонитевые выступающие концы, которые не являются комплементарными концами 375 Ьр кДНК-фрагментаОбъединенный фрагмент, содержащий синтетическую последователъность для метионина (1-13 аминокислот), и встречающаяся в природе последовательность кодирования для аминокислот 14-86 проинсулина составляет последовательность кодирования для проинсулина.Проинсулин-кодирующую последовательность конструируют избирательным разрывом у внутреннего положения в проинсулин-кодирующей области с последующим пришиванием химически синтезированной последовательности, кодирующей ту часть проинсулин-кодирующего участка, который удален предшествующим расщеплением, Плазмиду рсН 1-1 используют в качестве источника проинсулин-кодирующего участка, который избирательно исключают обработкой НЬа 1-эндонуклеазой.Любой фрагмент после выделения обрабатывают щелочной фосфатазой для удалейия 51-концевых фосфатных групп, затем расщепляют эндонуклеазой А 1 ц 1, имеющей уникальную точку расщепления в области 3- 14 аминокислот в прони сулин-кодирующей последовательности. Местоположение ограничения предпочтительно располагают вблизи одного иэ, концов проинсулин-кодирующей последовательности, НЬа 1-фрагмент - рсН 1-1 частично разрывают А 1 ц 1-эндонуклеазой с получением двух фрагментов длиной приблизительно 76 Ьр и 375 Ьр соот-, ветственно. А 1 ц 1-фрагменты фракционируют методом гельэлектрофореза и выделяют фрагмент 375 Ър. Нуклеотидную последовательность, кодирующую первые 13 аминокислот про 3инсулина с 5 -концевым С (на плюс-нити), для завершения кодона на алании в положении 14 синтезируют фосфотри10рго аар рго о 1 а а 1 а о 1 о рЛв ча 1 азв 91 п Лге 1 сц сую 91 у зег Л 1 х 1 еи Я 3 дйССТ САС ССА ССС ОСА ССС ТТТ СОС ААС САА САС СТССС ССС 1 СЛ САС СТС СТ 6 АЯ14 сса Ъгуа 1 а 1 еиэгССТ СТС ЫиГА 1 н 1 20 Л 7йуг 1 ен ча 1 суз д 1 у 91 и огд д 1 у РЛе рМе 1 уг 1 Лг Ргв Туев Лг вгд аг 9 д 1 а а 1 оТАС СТА СТС ТСС ССС САА ССЛ ССС ТТС ТТС ТАС АСА ССС ААС АСС ССС ССС САС ССАди азрСАС САС 301 ен 91 н чо 1 д 1 у драп уа( д 1 и 1 ец д 1 у дну д 1 у рго аи о 1 а дну хег 1 еи дЬ рга стс ссс стс ссс ссс стс ссс стс ссс ссс ссс сст сст ссс ссс Асс стс ссс сссаас Ю ахеи а 1 а ТТЬ ССС И 7 ЮМец 91 ц д 1 у зег 1 сц 91 в 1 ую агд оц 1 е ча д 1 ц агап сую суй Ьг зег 11 в савв СТС САС ССС ТСС СТС САО ААС ССТ ССС АТТ СТС САА САА ТСС ТСТ АСС АСС АТС ТСС зег 1 енТСС СТСво1 уг 91 п 1 енТАС ДАС СДАф 1ЯХд 11 вб 91 н аеп 1 уг суг адСАС ААС ТЛС ТСС ААС ТАС АСССАССССССАСССАСССССССА СССССССССТССТССА СОАСАСАСАТССААТАЛАССССТТСААС САСС 5 1494345б эфирным методом. Плюс-нить синтетиче- П р и м е р 3. Клонированные ской ДИК и: ет последовательность: вставки, кодирующие на препроинсулин 3 -ТТТСТСААССААСАССТСТСССССТСАСАССТС- (пример 1) или проинсулин (пример 2), СТССААС"5 ,соответствующую природной вставляют в вектор переноса экспреспоследовательности, сии. Когда вставка происходит приРезультирующей последователь- правильной ориентации, относительно ностью является последовательность, начала трансляции у местополоаения сшитая тупым концом с приблизительно вставки, она находится в фазе отно Ьр фрагментом НЬа 1-фрагментом 10 сительно фрейма считывания, рсН 1-1. Поскольку последний имеет5 -фосфат только на присоединяемом ф о р м у л а и э о б р е т е н и я конце, два фрагмента соединяют в правильном порядке. Синтетический фраг. Способ получения фрагмента нумент правильным обраэом соединяют с 15 клеиновой кислоты, кодирующего проинбольшим фрагментом в приблиэительно сулин человека со следующей нуклео" 507 реакции. тидной последовательностью:-74 "-70 -тОтес а 1 а 1 еи игр теВ огд 1 еи 1 ен рго 1 еи 1 ец о 1 а 1 еиеи оа еиссттстсссатс ссс стс тсс дтс ссс стс стс ссс стс стс с с сто стс ссс стс,1 гр 91 УТСС ССА Ойй 11494345 выделяют фрагмент длиной 375 Ьр илигируют ДНК-лигазой Т с фрагментомдлиной 43 Ьр химически синтезированной нуклеотидной последовательности3 -ТТТСТСААССААСАСС ТСТСССССТСАСАССТССТСС ААС, кодирукицей 1-14 аминокислоты проинсулина, оканчивающейсягайтом А 1 о 1. заключающийся в том, что клетки островков Лангерганса центргфугируютв растворе, содержащем 5,7 М СзС 1и 00 мМ ЭДТУ, отделяют РНК препроинсулина, синтезируют кДНК, полученную кДНК встраивают в Рз 11 сайт плазмиды рВЕ 322 с помощью дА-олиго- йТметода, трансформируют рекомбинантной плазмидной ДНК штаммы бактерийЕвсЬегдсЬда со 1 ь и отбирают клоны,гибридизующиеся с клонированной кДНКпрепроинсулина крыс, содержащей радиоактивную метку, выделяют из нихплазмиду рсНГсо вставкой кДНК препроинсулина, обрабатывают рсН 1-1 эндонуклеазой НЬа 1 с последующим частичным гицролиэом А 1 ц 1 эндонуклеазой,2, Способ по и.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что плазмиду рсН 1-1 обрабатывают эндонуклеазой НЬа 1, выделяют фрагмент длиной 375 Ър, который тупоконечно лигируют с нуклеотидной последовательностью 3 -ТТТСТ СААССААСАССТСТСССССТСАСАССТССТССААССоставитель Н,КузенковаРедактор М;Келемеш Техред А,Кравчук Корректор М.Максимишинец Заказ 3765/59 Тираж 500 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,10