Вектор рмв 123 для получения фрагментов днк с произвольными липкими концами и способ его конструирования

(19) (11) 12 К ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССС О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ ИОТНРЫТ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии(54) ВЕКТОР рМВ 123 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯФРАГМЕНТОВ ДНК С ПРОИЗВОЛЬНЫМИ ЛИПКИМИ КОНЦАМИ И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВА-НИЯ(57) Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инженерии и представляет собой векторнуюДНК рМВ 123 для получения фрагментовДНК с произвольными липкими концами. Полученная рекомбинантная плазмиднаяДНК имеет молекулярную массу 1,8 МДи содержит ЕсоК 1 - Рзс 1 ФрагментДНК ллазмиды РЧК 222 с геном В-лактамазы и частью модифицированного гена В-галактозидазы Е.со 1, а такжесинтетический полилинкер длиной38 п,о. Полилинкер включает междупопарными сайтами РоЕ 1 и Няа 1 набор сайтов для эндонуклеаз рестрикции Ва 1 С 1, Асс 1, Нхпй 11, Ньпй 111и Ваш Н 1 противоположной полярности .Целевые Фрагменты ДНК получают путемклонирования субфрагментов в составесконструированной векторной плазмиды . рМВ 123 по сайтам, соцержащимсямежду нопарными сайтамн Ро 1 1 и Неа 1с последующим их выщеплением с помощью рестриктаз Ро 1 1 или Неа 1.2 с,п, ф-лы,(1 Ч) СААТТСТССАТСАССССС Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, конкретно к получению векторных рекомбинантных ДНК методами генетической инженерии и может найти применение в биотехнологии при создании штаммовпродуцентов целевых продуктов,с находящимися между попарными сайтами эндонуклеаз рестрикции РоЕ 1 и Няа 1 местами для эндонуклеаз рестрикции Ба 1 С 1, Асс 1, Н 1 пй 11, Ндпй 111 и ВавН 1.Конструирование вектора рМВ 123 проводят следующим образом. 20Расщепляют ДНК плазмиды рВ 1 МВ эндонуклеазами рестрикции ВавН 1 и Есо 8.1 и лигируют полученный гидролизат с синтетическими.олигонуклеотидами САТСССССТСАТССАС и ААТТСТССАТ САСССС с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т 4. Полученной смесью трансформируют клетки Е.со 1 х ВМН 7118 или 1 М 103 и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллину,с фенотипом Ьас" 30 (промежуточная плазмида рМВ 121) . Из индивидуальных клонов выделяют ДНК плазмиды рМВ 121, которую расщепляют эндонуклеазами рестрикции Рз 1 и Ба 1 С 1 и лигируют с олинонуклеотидами ССАТСАСССС и ТССАССССТСАТССТССА.Полу- ченной лигазной смесью трансформируют клетки Е,со 11 и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллину, с фенотипом Ьас (плазмида рМВ 123). 40Конструкция рМВ 123 облегчает поиск колоний с рекомбинантными плазмидами, Поскольку полилинкер для клонирования субфрагментов расположен в кодирующей последовательности 1 - 45 пептида В-галактозидазы,вставка суб фрагмента может нарушить его рамку считывания и привести к изменению фенотипа, полезному для селекции рекомбинантов,В качестве клетки-хозяина при работе с вектором рМВ 123 удобно использовать Е.со 1 с делецией в начале гена В-галактозидазы, например, Е.со Ьас 2 йМ 15. Плазмида рМВ 123 благодаря Ы-комплементации с хромосомным геном Ьас 2 сообщает таким бактериальным клеткам фенотип Ьас который при вставке субфрагмента обЦель изобретения - создание вектора, позволяющего получать клонируемые в нем фрагменты ДНК с произольными "липкиьй" концами,Сконструирован вектор рМВ 123,состоящий из ЕсоК 1-Рз 1 фрагментаДНК вектора РЖ 222 и полилинкера: щей длиной Зп +1 п,о., либо если внутри его находится АТС-кодон, содержа- . щий Зп или Зп+1 п.о. от этого АТС- кодона до 3 -конца субфрагмента, изменяется на Ьас , что позволяет легко отбирать колонии с рекомбинантными плазмидами (не окрашенные на индикаторной среде с Х-Са 1),П р и м е р 1, Химический синтез олигонуклеотидов ТССАССССТСАТССТССА; (и) проводят твердофазным фосфотриэфирным методом. В качестве носителя используют модифицированный силохром. Наращивание олигонуклеотидной цепи проводят от 3 -к 5 -концу с помощью динуклеозиддифосфатных производных (МеО) ТгИр (РЬС 1)Ир(РЬС) . Выделение целевого продукта после деблокирования реакционной смеси проводят путем последовательных хроматографий на ЬспгозогЬ РК 18 сначала в О, 1 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетонитрила 15-40, Затем раствор выделенного тритилолигонуклеотида упаривают досуха, растворяют в 2,5 мп 80 -ной водной уксусной кислоте и выдерживают при комнатной температуре 45 минРаствор упаривают досуха, растворяют остаток в 1 мп дистиллированной воды и хроматографируют на ЬсЬгозогЬ РК 18 в 0,05 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетонитрила 5-20%.Конструирование целевой векторной ДНК рМВ 123 состоит из двух этапов, На первом этапе конструируют.промежуточную плазмидную ДНК рМР 121,1446 59 П р и м е р 2, Получение субфраг" мента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствующую 60-98 аминокислотам человеческого интерлейкина, с заранее запланированными "липкипи" концами.Описанным способом синтезируют и выделяют следующие полинуклеотиды: 5 СССАСАТСТАСААСААСААСТСАААССТСТССААСААСТС; (Ч) 5 СААААТТТТТСАТТТСТССТАААТТСАССАСТТСТТССАС (Ч 1) 5 АСТТАССТСССССТСАСТТААТСТССААТАТСААССТТААТ 3 (Ч 11) 5 ССТСТССАСССТТСАСТТССАСТАСААТТАССТТСАТА (Ч 111)Из полинуклеотидов Ч-Ч 111 получают этанол), нагревают 10 мин при 50 С, дуплексы для клонирования. охлаждают до 20 С, добавляют йЯТР доРеакционную смесь, содержащую по концентрации 250 мкм и 10 ед, ДНК-по пкмоль меченного -РАТР поли- лимеразы 1 (фрагмент Кленова). Реаку55нуклеотида (Ч) и фосфорилированного ционную смесь инкубируют 30 мин при холодным АТР полинуклеотида (Ч 1) в 20 С, добавляют 10 мкл 0,4 М ЭДТА, 100 мкл буфера 3 (60 мМ трис-НС 1, рН 8,0 и экстрагируют водным фенолом.1 рН 7,5; 10 мМ МЕС 1, 19 мМ 2-меркайтол- ДНК-дуплекс осаждают ацетоном, содер 5 мкг ДНК плазмиды рИТМВ гидролизуют совместно эндонуклеазами рестрикции ВащНТ и ЕсоКТ в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 (20 мМ трис-НС 1, рН 7,8,10 мМ МеС 1, 10 мМ 2-маркаптоэтанол) и 100 мМ ИаС 1 при 37 С 1 ч. Реакционную смесь после добавления 5 мкл 0,4 М ЭДТА, рН 8,0 экстрагируют равным объемом водного фенола и нзоамилового спирта. Затем к реакционной смеси добавляют ИаАс до концентрации 0,3 М, рН 7,0 и осаждают ДНК двумя объемами этанола. Полученный препарат вектора рИТМВ растворяют в 15 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-НС 1, рН 7,8; 1 мМ ЭДТА).К 5 мкл раствора вектора рБТМВ добавляют по 20 пмоль олигонуклеотидов (1 Т 1 и 1 Ч), 2 ед. ДНК-лигазы фа га Тв 30 мкп буфера 2 (20 мМ трисНС 1; рН 7,5, 10 мМ МяС 1, 10 мМ 2- маркаптоэтанол и 0,5 мИ АТР).Реакционную смесь выдерживают 12 ч при 10 С, затем используют для 25 трансформации клеток Е,со 13. ВМН 7118, Суспензию клеток после трансформами высевают на 1,57 ЬВ агар, содержащий 75 мкг/мп ампициллина и 50 мкг/мп Х-Са 1.Чашки инкубируют 12 ч при 37 С, Зо Из колоний, имеющих Ьас фенотип, щелочным методом выделяют ДНК плазмиды рМВ 121. Взр 1 и Го 1 с 1 гидролизаты полученной ДНК анализируют в 4 Х ПААГ. Клон, имеющий дополнительный Ро 1 1- сайт в плазмидной ДНК, выращивают . в 100 мп среды, содержащий 50 мкг/мпо апициллина, в течение 16 ч при 3 С на качалке (200 об/мин). Клетки собирают центрифугированием (6000 об/мин, 4 О 10 мин, 4 С), плазмидную ДНК рМВ 121 выделяют щелочным методом с последующей дополнительной очисткой в градиенте плотности СзС 1.5 мкг ДНК плазмиды рМВ 121 расщепляют 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Рз 1 в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 и 50 мМ МаС 1, 1 ч прио37 С. Затем к реакционной смеси добавляют ИаС 1 до концентрации 150 мМ, 2-меркаптоэтанол до 20 мМ и 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Яа 1 СТ, выдер-. живают 1 ч при 37 С. Реакционную смесь после добавления 6 мкл 0,4 М ЭДТА, рН 8,0 экстрагируют равным объемом водного фенола и изоамилового спирта, ДНК вектора рМВ 121 осаждают этанолом и растворяют в 50 мп ТЕ- буфера.5 мкл раствора ДНК плазмиды рМВ 121 отбирают для получения вектора рМВ 123, К реакционной смеси добавляют по 20 пкмоль олигонуклеотидов 1 и Т 1, 2 ед. ДНК-лигазы фага Т 4 в 30 мкл буфера 2 и выдерживают 12 ч при 10 С. Полученной лнгазной смесью трансформируют клетки Е.со 1 з. ВМН 7118. Из колоний (получевюе см.выше) имеющих Ьас фенотип, выделяют плазмидную ДНК. После рестрнкционного анализа с помощью Взр 1 и РОЕТ эндонуклеаз определяют ее первичную структуру в районе встроенного полилинкера по методу Максама-Гилберта./ высушенный осадок растворяют в воде., Полученный дуплекс расщепляют Обработкой 200 ед эндонуклеазы Вц 1 11 в 200 мкл буфера 2, содержащегоо 50 мМ ИаС 1, в течение 12 ч при 37 С, Аналогично получают дуплекс из полинуклеотидов (Ч 11 и Ч 111), который затем расщепляют обработкой 500 ед, 10 эндонуклеазы Ба 1 С 1 в 200 мкп буфера 2, содержащего 150 мМ ИаС 1, в течение 12 ч при 37 С. Оба рестрикта выделяют с помощью гель-электрофореза в 8% ПААГ. 15Реакционную смесь, содержащую по 2 пмоль приготовле:ных дуплексов и 0,25 пмоль векторной Днк, получен-ной из рМВ 123 совместным расщеплением эндонукпеазами рестрикции ВашН 1 20 и Ба 1 С 1 (условия см, выше), обрабатывают 2 ед. ЦНК-лигазы в описанных условиях, Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е,со 1 ВМН 7118 или 1 М 103 ДНК, выделенные25 из колоний, имеющих 1.ав фенотип, гибридизуют сР-меченьпя зондами, полученными из полинуклеотидов (Ч и Ч 111). ДНК, гибридизующиеся с обоими зондами дополнительно анализи руют с помощью Взр 1 и ЕсоН 1+Рзг,1 гидролиза.Колонии, имеющие плазмиды р 11, 912 со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 мп ЬВ среды. Для полу. - чения целевого субфрагмента, коди-. рующего часть гена человеческогои 1 Ьс заранее запланированными лип: - . кими" концами, 15 мкг ДНК плазмиды р 1 Е 9 12 в 150 мкп буфера 1, содержа щего 50 мМ НаС 1, обрабатывают 20 ед. эндонуклеазы регистрикции РОК 1 или Няа 1 при 37"С. Целевой фрагмент длиной 114 нуклеотидных пар выделяют с помощью электрофореза в 6% ПААГ. Структура полученного фрагмента подтверждена методом Максама-Гилберта. П р и м е р 3. Контроль на коньюгативность плазмиды рМВ 123. 50Плазмидную ДНК рМВ 123 трасформируют по описанной методике в штамм Е.со 1 ВМН 7118. Колонии, выросшие при 37 С за 16 ч на 1,В агаре с ампициллином (АР 50 кг/мл), пересевают в 1.В-среду с тем же антибиотиком.и растят ДО плотности Д5 О - 1 ф Ночную куль туру штамма 1 М 103 засевают и растят ;в тех же условиях да плотности Д=1. Культуры смешивают в равньо объемах по 0,5 мп, инкубируют 1 ч при37 С, покачивая. После чего 100 мклс зси высевают на 1,В агар, содержащейангибиотики Ар (50 мкг/мп) и Ясг(100 мкг/мп), и оставляют на ночьпри 37 С. Стерильность, на чашках сохраняется. Эффективность коньюгациименьше 10 ,Таким образом, применение векторной пЛазмиды рМВ 123 для получениясубфрагментов с заранее запланированными "липкими" концами имеет существенные преимущества по сравнению спрототипом. Прежде всего конструкциявекторной ДНК рМВ 123, содержащая между гопарными сайтами эндонуклеаз рестрикции РОЕ 1 и Н 8 а 1 противоположнойориентации, набор сайтов для рестриктаз Ба 1 С 1, Асс 1, Нхдя 111, ЗашН 1 даетвозможность клонировать фрагмент изнескольких частей и таким образомполучать протяженные химически синтезированные последбвательности ДНК,В примере 2 субфрагмент гена человеческого интерлейкинаполучен издвух дуплексов за одно клонирование.Получение этого же субфрагмента вплазмидах типа рВВч потребует трехклонирований, В этом случае необходи-.мо проклонировать отдельно каждыйиз тупоконечных дуплексов, а затемпосле получения "липких" концов осуществить сборку в субфрагмент в другом векторе. Применение рМВ 123 дляполучения целевых последовательностейДНК позволяет уменьшить объем биохимической и генно-инженерной работы внесколько раз. Несомненным преимуществом является использование при получении ппоизвольных "липких" концовсубфрагментов коммерчески доступныхэндонуклеаз рестрикции ГО 1 и Няа 1.Векторная плазмида рМВ 123, позволяющая получать субфрагменты с заранее запланированными "липкими" концами находит применение при получении .генов и их фрагментов, ценных белков, конструировании регуляторных элементов транскрипции и трансляции,Формула и зобр ет ения1. Вектор рМВ 123 для получения фрагментов ДНК с гроизвольными лип - кими концами смол массой 1,8 МЦ, содержащий -Есог 1-Рзг.1 фрагмент ДНК1446159 ССАТСАССССТССАСААСССТТССАТСССССТСАТССАСАССТССТАСТССССАССТСТТССААССТАСССССАСТАССТСТТАА фрагменты размером 8, 84, 181,244, 287, 614, 1254 п.о., образующиеся после расщепления эндонуклеазыРо 1 с 1;вставку субфрагмента для клонирования по Ба 1, С 1 и ВашНЕ-сайтамполилинкерной области;ген В-лактомазы, определяющийустойчивость к ампициллину,емкость не менее 622 п.о.,30 35 Составитель Т.Забойкина Редактор Н,Гунько Техред Л,Олийнык Корректор А.Обручар.Заказ 6706/30 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 плазмиды рЧК 222 с репликоном плазмиды рЧК 222 геном И-лактамазы и частью модифицированного гена И-галактозидамежду попарнымн сайтами эндонуклеаз 10 рестрикции РоК 1 и Неа 1 которого расположены сайты для эндонуклеаз рестрикции Ва 1 СЕ, Асс 1, Нпя 11, Ндпе 111 и ВашНЕ противоположной полярности;фрагменты размером 11, 80, 100174,15 257 (область полилинкера), 267, 290, 434, 457, 587 п.о образующиеся после расщепления эндонукпеазы Ввр 1; фрагменты размером 26, 34, 67, 20 110, 147, 200, 242, 404, 420 (область полилинкера) 489, 500 п.о образующиеся после расщепления эндонуклеазы ДНКф зы ЕсЬегдсйа со 1 д, синтетический полилинкер размером 38 п,о., имеющийструктуру штаммы-хозяева: штаммы Е.со 1 д с Ьас 2 ЙМ 15 фенотипом.2, Способ конструирования нектора рМВ 123 для получения фрагментов ДНК с произвольными липкими концами, заключающийся в том,что ДНК рй 1 МВ расщепляют с помощью эндонуклеаз рестрикции ЕсоК 1 и ВашН 1, подученную векторную ДНК лигируют с синтетическими олигонуклеотидами САТСССССТСАТССАС и ААТТСТССАТСАСССС с помощью ДНК-лигазы фага Т 4, лигазной смесью трансформируют клетки Е.со 11, из трансформанты, имеющих фенотип Ьас выделяют ДНК, расщепляют эндонуклеазами рестрикции Рвй 1 и Ва 1 СЕ, выделяют векторную ДНК, которую лигируют с синтетическими одигонуклеотидами ССАТСАССССТССАССССТСАТССТССА с помощью ДНК-лигазы фага Т 4, вновь трансформируют клетки Е,со 1 д, среди транс формантов, устойчивых к ампицкплину и имеющих фенотип Ьас , отбирают клоны, имеющие целевую первичную структуру ДНК в районе полилинкера плазмиды.