Фрагмент днк, кодирующий часть поверхностного белка сд4т лимфоцитов человека, ответственную за связывание с протеином др120 вируса иммунодефицита человека

СОЮЗ СОВЕТСИХсО 1 иАлистиче скихРЕСПУБЛИК ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ЕТЕЛЬСТВУ К АВТОРСКОМУ ЮЩИЙ СД 4 Т- ЕТСТЕ С МУНООСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯРИ ГКНТ СССР(72) Э.Е.Галеев. А.П.Гузаев. Б,К.Чернов, О Ю.Смирнов, В.М,Абрамов и В.П.Завьялов (56) ЮСЬагдзоп М.Е., Кода зла М ВгоУчп М,с., СЬапц Нзц-СЬпд. Р 1 сапо 1 с.Е,. ес. а А зо 1 цЫе С 04 ргосеи зеестчеу пЫЫь НИ гер 1 са 0 оп апд зупсусцв 1 огвасоп, - Масцге, 1988, ч.331, п.651, р, 78-81.Агтйоз,)., Оееп К,С,. СЬа 11 с 1 п М.А., Гогваа 1 д 1.А., Яайе 6., ес. а. депсИсас 1 оп о 1 тле гездиез 1 п Ьцвап С 04 сгтса аког тле Ыпдпц о 1 Нч, - Се, 1989, ч.57, и, 3, р.469-481.1 апдац И.ЙИ/агтоп М.,1.тсвэп О.й, ТЬе епчеоре 91 усоргосеп о сне Ьцвап ввцподе 11 с 1 епсу чгцз Ьпдз 1 о сне 1 ввцподоЬц 11 пее довзи о С 04. - йатцге, 1988, ч. 334, и, 6178, р. 159-162,ЯУчеет К., Агйоз, Оееп КРогпаа 1 д .СЬа 1 си Мет, а 1. 1 пЫЬ 11 оп о 1 йе Н 1 Ч/51 ч чгцзез Ьу зоиЫе депчасчез о 1 Т 4. - .Се. В 1 осЬев., 1989, 5 црр 13 В, р. 241.Ватез Р.А Мсбгецог М,11 з 1 ав Б.А., Яатсептац О., 51 егпЬегд М,З,Е. А ргедссед ТЬгее-д 1 вепз 1 опа зтгцссцге аког йе Ьцвап 1 ввцподейп 1 епсу чгцз Ьпдпц довапз о 1 С 04 апт 1 деп, - Рготе 1 п Епц 1 еетпц, 1989, ч, 3, и. 1. р. 13-21,КеЬе 1-Еввопз Т,1 агпезоп В,А., Моггочч Ю,.),Ю ТЬе др 120 СО 4 1 псе 1 асе: зтгцссцга 1, в в ил ооц 1 са апд ратЬо 1 оц 1 са сопз 1 дегат 1 опз. - ВосЬев, ВпрЬуз, Ас а, 1989, ч. 989, и, 3, р. 281-300.ТаЬасгеччз 1 с Р 8 сЫе зег 6., И/е 1 зз Е.Н В 1 еЬег Е.Р Вес 1 твц 11 ег 6. О 1761808 А Д 15 С 12 //15/48,С 12 О 1/бВ, С 12 Р 1 КесовЬпалс С 04 роурерсдез то сЬагастегае Тцпстопа ерторез о 1 с 11 е С 04 п 1 о 1 есц 1 е. - 1 втпипоЬооцу, 1988, ч, 178. и 1-2, р.116.СЬао В,Н., Созтороц 1 оз 0.8 Сцпе Т., Вегтоп 1 з,3,М., СЬГзлов Р., ет. а 1- А 113- ав 1 по асд 1 гадвеп 1 о 1 СО 4 ргодцсед п Е.со Ыос 1 з Ьцвап ввцподеПсепсу чгцзпдисес 1 сеИ 1 цзоп. - Во 1. Спев,. 1989. ч, 264, п,10, р. 5812-5817.Международная заявка РСТИ 88/01304, кл, С 12 О 1/68, 1988. (54) ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУ ЧАСТЬ ПОВЕРХНОСТНОГО БЕЛКА ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, 01 В ВЕННУЮ ЗА СВЯЗЫВАНИ ПРОТЕИНОМ 6 Р 120 ВИРУСА ИМ ДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: молекулярная биология, генноинженерная биотехнология. Сущность изобретения; получена синтетическая ДНК аЬс с оптимизированным для Е зсЬегСЬ 1 а со 1 кодоновым составом, кодирующая область АВС: 1-185 поверхностного белка СД 4 Т-лимфоцитов человека, ответст- а венная за связывание с гликопротеином др 120 вируса иммунодефицита и ее фрагмен- О тов а,Ь,с, аЬ, кодирующих соответственно области СД 4, А: 1-60, В: 59-110, С: 109-185, АВ: 1-110. Фрагмент а с кодируют два концевых домена СД 4 субфрагмента а - первый центр связывания с гликопротеином цр 120 ВИЧ, субфрагмент Ь - второй центр связывания, субфрагмент с - второй домен белка а СД 4, субфрагмент аЬ - оба центра связывания. 1 ил.:Ь% ИЕ":-Ъ ПШ НиЫЮхай ,еде и:лигирадоние Составитель А,ГузаевТехред М,Моргентал Корректор Н.Коро Редакт около аказ 3236 ВНИИПИ Государ Тиражственного комитета по изобр 113035, Москва, Ж, Рау Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 10 рисе Рз/ юруф (ас ) 1:П:Пгф КрнЦ Подписноетениям и открытиям при ГКНТ ССС кая наб., 4/55 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Изобретение относится к молекулярной биологии и генноинженерной биотехнологии и касается получения ДНК, кодирующей часть поверхностного белка СО 4 Т-лимфоцитов человека, ответственную за связывание с гликопротеином цр 120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), и ее фрагментов, продукты экспрессии которых могут найти применение при исследовании молекулярных механизмов развития синдрома приобретенного иммунодефицита человека (СПИД), диагностики ВИЧ, терапии и профилактики СПИД,Известна кДНК, полученная из природной мРНК, кодирующая 374 аминокислотных остатка (АКО) И-концевой области поверхностного белка С 04 Т-лимфоцитов человека, ответственной за связывание с гликопротеином цр 120 ВИЧ.Недостатком данной ДНК является наличие участков, кодирующих фрагменты белка С 04, функционально незначащих для связывания с гликопротеином цр 120 ВИЧ, поскольку извесно, что наиболее важной для связывания является область СО 4 с 1 по 106 АКО, с 37 по 83, с 41 по 55, с 40 по 60, с 36 по 49 и с 81 по 92, существенна для связывания также область с 83 по 159 АКО; отсутствие удобных сайтов рестрикции для уменьшения ее размера.Известны фрагменты кДНК, полученной из природной мРНК, кодирующие поли пептиды М-концевой области СО 4 протяженностью 388, 351, 152 АКО.Недостатки ДНК, кодирующих первые два полипептида, также заключаются в избыточной протяженности, Недостатки ДНК, кодирующих полипептид протяженностью 152 АКО состоят в том,что они значительно перекрывают участок, минимально необходимый для связывания цр 120 и в то же время не включают весь фрагмент, взаимодействующий с цр 120.Известны также фрагмент кДНК, кодирующий полипептид й-концевого района СО 4 протяженностью 113 АКО, соответствующий последовательности первого домена и междоменного участка белка.Недостатками известного фрагмента являются, во-первых, его кодоновый состав, нехарактерный для прокариотов вообще и Е.соИ в частности, во-вторых, отсутствие сайтов рестрикции, позволяющих уменьшить их размер для локализации минимального фрагмента связывания белка цр 120,Наиболее близкими по сущности и достигаемому результату являются фрагменты кДНК, кодирующие полипептиды М-концевой области С 04 протяженнос 1 ью с -23 по 374, с 1 по 111, с 112 по 181, с 287 по 374, и с 182 по 286,АКО,Общими недостатками этих фрагментов являются: неоптимальный кодоновый состав для экспрессии в прокариотических организмах и, в частности, в Е.со; неоптимальный, избыточный размер фрагментов: фрагмент 1-111 кодирует сразу оба центра связывания с белком цр 120, последние два из заявленных фрагментов кодируют полипептиды 287-374 и 182-286, несущественные для связывания с белком др 120, а первый фрагмент кодирует полипептид -23-374, соответствующий всей растворимой части белка СО 4, включающей в себя протяженные области-0 и 182-374, также несущественные для связывания. В то же время отсутствуют удобные сайты рестрикции для генноинженерных манипуляций, позволяющих уменьшить размер фрагментов до оптимальных величин, определяемых размерами центров связывания белка СО 4, Неоптимальный кодоновый состав для экспрессии в прокариотах и отсутствие достаточного количества удобных сайтов рестрикции обусловлено происхождением фрагментов из кДНК-копии мРНК эукариотического (человеческого) гена СО 4,Целью настоящего изобретения является получение синтетической ДНК, кодирующей часть поверхностного белка СО 4 Т-лимфоцитов человека. ответственную за связывание с гликопротеином цр 120 вируса иммунодефицита человека, кодоновый состав которой оптимизирован для ЕзсЬегсЫа соИ.Поставленная цель достигается получением синтетической ДНК аЬс с оптимизированным для ЕзсЬепсЬа со кодоновым составом, кодирующей область АВС: 1-185 поверхностного белка С 04 Т-лимфоцитов человека, ответственную за связывание с гликопротеином цр 120 вируса иммунодефицита человека, и ее фрагментов а, Ь, с, аЬ, кодирующих соответственно области С 04: А: 1-60, В: 59-110, С: 109-185, АВ; 1-110.Фрагмент аЬс кодирует два И-концевых домена СО 4, субфрагмент а - первый центр связывания с гликопротеином цр 120 ВИЧ, субфрагмент Ь - второй центр связывания, субфрагмент с - второй домен белка СО 4, субфрагмент аЬ - оба центра связывания, Ниже приведены нуклеотидные последовательности фрагментов а,Ь,с и фрагментов аЬ и аЬс.Изобретение осуществляется следующим образом, Твердофазным автоматическим фосфитамидным методом синтезируют олигодезоксирибонуклеотиды(1-16), выходы и свойства синтетических олигодезоксирибонуклеотидов (1-16) и редставлены в таблице.Ол игодезоксирибонуклеотиды (2,3,5,7- 10,12,14,15) фосфорилируют АТФ по 5 -концу с помощью полинуклеотидкиназы (ПНК) фага Т 4. Соединения (1-3, 9-11) ипи (4,5,12,13) или(6-8, 14-16) смешивают в эквимопекулярных соотношениях, нагревают при 95 С в течение 5 мин, охлаждают до комнатнои температуры в течение 3 ч, проводят межнуклеотидную сшивку ДНК-лигазой фага Т 4, Продукты соответствующих длин выделяют электрофорезом в ПААГ, получают фрагменты (а) или (Ь) или (с) соответственно.Фрагмент (а) смешивают с векторной ДНК плазмиды рОС 19, предварительно ресщепленной рестриктазами Рвт 1 и Крп 1, а фрагменты (Ь) или (с) - с векторной ДНК плаэмиды рОС 18, расщепленной теми же рестриктазами. обрабатывают ДНК-лигаэой фага Т 4. Полученными смесями трансформируют клетки Е,со .М 103, трансформанты отбирают на селективной среде с ампициллином. Рекомбинантные ДНК со вставками нужной длины выявляют рестриктным анализом плазмид, выделенных из полученных клонов, Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов подтверждают секвенированием по методу Сэнгера. Наработкой плазмид, включающих фрагменты заданных нуклеотидных последовательностей, получают рекомбинантные ДН К рРСО 4 а, рРС 04 Ь.8, рРСО 4 ссоответственно, содержащие фрагмент(а) и Рзт 1-Крп 1 - фрагмент вектора рОС 19, фрагмент (Ь) и Рзт 1-Крп 1 - фрагмент вектора рОС 18, фрагмент (с) и Рзт 1-Крп 1 - фрагмент вектора рОС 18,Для получения рекомбинантных ДНК, содержащих фрагменты (аЬ) и (аЬс) и Рз 11 Крп 1 - фрагмент вектора рОС 19, рекомби нантную ДНК рРС 04 Ьрасщепляют рестриктазами Вд 1 П и ЕсоВ 1 и выделяют фрагмент длиной 177 п.осмешивают его с векторной ДНК, полученной расщеплением рекомбинантной ДНК рРСО 4 арестриктаэами В 91 П и Есой 1 и обрабатывают ДНК- лигазой, Полученной смесью трансформируют клетки Е.со ЗМ 103, трансформанты отбирают на селективной среде с ампициллином. Рекомбинантную ДНК со вставкой нужной длины выявляют рестриктным анализом плазмид, выделенных из полученных клонов. Нуклеотидную последовательность сты ка подтверждают секвенированием по методу Сэнгера, Наработкой плазмиды, включающей фрагмент заданной нуклеотидной последовательности, получают рекомбинантную ДН К рРСО 4 аЬ, содержащую фрагмент (аЬ) и Рзт 1-Крп 1 - фрагмент вектора рОС 19. Рекомбинантную ДНК рРС 04 срасгцеппяют рестриктазами Рзт 1 и Есой 1, выделяют фрагмент длиной 251 п.осмешивают его с векторной ДНК, полученной расщеплением рекомбинантной ДНК рРСО 4 аЬрекстриктаэами Рзт 1 и ЕсоВ 1 и обрабатывают ДНК-лигазой. Полученной смесью трансформируют клетки Е.со .М 103. трансформанты отбирают на селективной среде с ампициллином, Рекомбинантную ДНК со вставкой нужной длины выявляют рестриктным анализом ппазмид, выделенных иэ полученных клонов. Нуклеотидную последовательность стыка подтверждают секвенированием по методу Сзнгера, Наработкой плазмиды, включающей фрагмент заданной нуклеотидной последовательности, получают рекомбинантную ДНК рРСО 4 аЬс, содержащую фрагмент (аЬс) и Рзт 1-Крп 1 фрагмент вектора р.С 19.Ниже приведена схема получения всех рекомбинантных ДНК,Фрагмент (аЬс) перекпонировали также в вектор М 13 вр 18. Рекомбинантную ДНК рРС 04 аЬобрабатывают рестриктазами НпбШ и ЕсоБ 1, выделяют фрагментдлиной 599 п,осмешивают его с векторной ДНК,полученной расщеплением РФ-ДНК М 13 гпр 18 теми же рестриктазами, и обрабатывают ДНК-лигазой фага Т 4. Полученной смесью трансформируют клетки Е,со ЗМ 103, Рекомбинантную ДНК со вставкой нужной длины выявляют рестриктным анализом РФ-ДНК фагов, выделенных иэ полученных бляшек, Наработкой ДН К, включающей фрагмент длиной 599 п,о., получают рекомбинантную ДНК М 13 СО 4 аЬс, содержащую фрагмент (аЬс) и ЕсоВ 1-НпсШ - фрагмент вектора М 13 тр 18.Сущность предлагаемого изобретения раскрывается из рассмотрения следующих примеров. П р и м е р 1, Синтез олигодеэоксирибоуклеотида 13.Синтез олигодезоксирибонуклеотида 13 проводят твердофазным амидофосфитным методом на синтезаторе 380 В (Арред Возуз 1 ег, США) в шкале 0,2 мкмоль с испольэов м широкопористой матрицы (намина .;,: д,аметр пор 800 А) по следующей программе: промывка и подготовка мономеров 23 с, конденсация 80 с, кэпирование 30 с, окисление 40 с, промывка 106 с. детритилирование 60 с, промывка 65 с. В качестве мономеров используют ч-ацил-О-диметокситритип-О-цианоэтил)- й,ч-диизопропиламидофосфит)-2 -дезокси 1761808рибонуклеозиды. причем если рибонуклеозид = аденозин или цитидин, то ацил = бензоил, если рибонуклеозид = гуанозин, то ацил = изобутирил, если рибонуклеозид = тимидин, то ацил отсутствует, В качестве активатора межнуклеотидной концентрации используют тетразол, детритилирующего агента 20 -ный раствор трихлоруксусной кислоты в дихлорметане, окислителя 0,1 М раствор иода в смеси пиридин-вода-тетрагидрофуран 2:20:75, кэпирующих реагентов: равные обьемы реагента И (уксусный ангидрид,6-лутидин-тет рагидрофуран 10:10;80) и реагента В (1-метилимидазол-тетрагидрофуран 16:84), растворителя для промывки и конденсации - ацетонитрил. После завершения последнего шага наращивания цепи 5-О-диметокситритильную группу не удаляют, готовый олигодезоксирибонуклеотид от-" щепляют от матрицы 300 -ным раствором аммиака и деблокируют в том же растворе в течение 8 ч при 60 С, Летучие продукты удаляют в вакууме, остаток растворяют в 1,0 мл воды. целевой продукт выделяют методом ВЭЖХ на колонке Косеоз 300-5 С 18 (4,бх 250 мм) в линейном градиенте ацетонитрилв (от 10 до 40 ) в 0,05 М ацетате аммония. Собранную фракцию упаривают досуха, к остатку прибавляли 2 мл 80%-ной уксусной кислоты, выдерживают 20 мин, упаривают досуха. Остаток растворяют в 1,0 мл воды, полностью деблокированный олигодеэоксирибонуклеотид выделяют методом ВЗЖХ на той же колонке в линейном градиенте ацетонитрила (от 5 до 30%) в 0,05 М ацетате аммония. Собранную фракцию упаривают досуха, дважды упаривают с 2 мл воды, растворяют в 1,0 мл воды и регистрировали УФ-спектр для определения выхода соединения 13. Воду упаривают, остаток переосаждают из 2%-ного перхлората лития в ацетоне, Получают 1.1 опт.ед. при 1= 260 нм (о.е.), что соответствует 30 мкг олигодезоксирибонуклеотида 13. П р и м е р 2, Фосфорилирование олигонуклеотида 2 по 5-концу, Растворяют 200 пмоль олигонуклеотида 2 в 50 мкл буфера. содержащего 50 мМ Трис-НС (рН 7,5), 10 мМ МЯС 2. 10 мМ ОТТ, 10 мМ спермидин и АТФ в концентрации 100 пмоль/мкл, прибавляют ПНК (10 ед) и инкубируют 40 мин при 37 С. Фермент инактивируют прогреванием 65 С в течение 10 мин,П р и м е р 3, Лигирование олигонуклеотидов 4,5,12,13. Получение фрагмента (Ь),Фосфорилированные олигонуклеотиды 5 и 12 и нефосфорилированные 4 и 13 (по 40 пмоль каждого) смешивают в 20 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-НС (рН 7,5), 10 мМ МоС 2, прогревают при 95 С в течение 5мин и равномерно охлаждают до комнатнойтемпературы в течение 3 ч. Прибавляют 30мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-НС5 (рН 7,5), 10 мМ М 9 С 2, 20 мМ ОТТ, 1 мМспермидин, 1 мМ АТФ, 50 мкг/мл БСА, при бавляют ДНК-лигазу фага Т 4 (2,5 ед) и инкубируют при 15 С в течение 16 ч. Продуктлигазной сшивки очищают электрофорезом.10 в 5 Я, ПААГ, Нужную полосу на электрофорезе выявляют при УФ освещении геля, прокрашенного бромистым этидием,П р и м е р 4, Получение рекомбинантнойДНК, содержащей фрагмент (а) и Рэт 1-Крп 115 фрагмент вектора рОС 19 (рРСО 4 а),10 пмоль фрагмента (а) смешивают вэквимолекулярном соотношении с векторной ДНК рОС 19, предварительно расщепленной рестриктазами Рзт 1 и Крп 1, в 20 мкл20 буфера, содержащего 50 мМ Трис-НС (рН7,5), 10 мМ М 9 С 12, 20 мМ ОТТ, 1 мМ спермидин, 1 мМ АТФ, 50 мкг/мл БСА, прибавляютДНК-лигазу фага Т 4 (2,5 ед) и инкубируютпри 15 С в течение 16 ч, В качестве контроля25 используют лигирование той же векторнойДНК на себя. Опытную и контрольную пробы осаждают этанолом, растворяют каждуюв 20 мкл буфера, содержащего 10 мМ МаС 1,5 мМ Трис-НС (рН 8,0), 10 мМ М 9 С 2 и обра 30 батывают рестриктазой ВапН 1, сайт узнавания которой локализован только вполилинкере рОС 19 между сайтами Рзт 1 иКрп 1. Полченной смесью трансформируюткомпетентные клетки Е,со ЗМ 103 и высева 35 ют на чашки с ампициллином. Получают 10 кратное превышение количества клонов вопыте над контролем. Наличие клонированного фрагмента выявляют рестриктным анализом плазмид, выделенных из полученных40 клонов (пример 6), а его структуру подтверждают секвенированием (пример 7). Плазмиду рРС 04 а, содержащую фрагмент (а)и Рзт 1-Крп 1-фрагмент вектора рОС 19, нарабатывают как описано в примере 6.45 П р и м е р 5, Получение рекомбинантнойДНК, содержащей фрагмент(Ь) и Рз 11-Крп 1- фрагмент вектора рОС 18 (рРСО 4 Ь),10 пмоль фрагмента (Ь) смешивают вэквимолекулярном соотношении с вектор 50 ной ДНК рОС 18, предварительно расщепленной рестриктазами Рвт 1 и Крп 1, в 20 мклбуфера, содержащего 50 мМ Трис-НО (рН7,5), 10.мМ Мо С 2,20 мМ ОТТ,1 мМ спермидин, 1 мМ АТФ,50 мкг/мл БСА, прибавляют55 ДНК-лигазу фага Т 4 (2,5 ед) и инкубируют0при 15 С втечение 16 ч. В качествеконтроляиспользуют лигирование той же векторнойДНК на себя. Опытную и контрольную пробы осаждают этанолом, растворяют каждуюв 20 мкл буфера, содержащего 10 мМ МаС.5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ИаС 1, 5 мМ Трис-НС (рН 8,0), 10 мМ М 9 С 12 и обрабатывают рестриктазой ВапН 1, сайт узнавания которой локализован только в полилинкере рОС 18 между сайтами Рзс 1 и Крп 1. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки Е.со 1 Л М 103 и высевают на чашки с ампициллином, Получают 15- кратное превышение количества клонов в опыте над контролем. Наличие клонированного фрагмента выявляют рестриктным анализом плазмид, выделенных из полученных клонов (пример 6), а его структуру подтверждают секвенированием (пример 7), Плазмиду рРСО 4 Ь, содержащую фрагмент (в) и Рзт 1-Крп 1-фрагмент вектора рОС 18, нарабатывают как описано в примере б.П р и м е р б, Выделение плазмидной ДН К.Плаэмидные ДНК выделяют методом экстракции фенол/хлороформ, Для этого 3 мл культуры Е.со 1, содержащей плазмиду рРС 04 свыращивают в течение ночи на качалке (200 об/мин) в бульоне Хоттингера, клетки осаждают центрифугированием в центрифуге Еррепс 1 огт" (4 мин при 4000 об/мин), Осадок суспендируют в 200 мкл раствора, содержащего 2,5 МС 1, 50 мМ Трис-НС 1(рН 8,0), 4(ч/ч Тг 1 топ Х, 62,5 мМ Ма ЕОТА, к полученной суспенэии добавляют 200 мкл смеси фенол/хлороформ/иэоамиловый спирт (25/24/1) и интенсивно перемешивают втечение 15 с. После центрифугирования в течение 10 мин при 14000 об/мин переносят водную фазу в новую пробирку и разбавляют в 3 раза водой, ДН К селективно осаждают центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 мин непосредственно после добавления в пробирку 200 мкл 40 оПЭГ 8000 и интенсивного перемешивания. Промывают осадок плазмиднойДНК 80 этанолом, высушивают в вакуумном эксикаторе и растворяют в воде. Полученную таким образом ДНК рРС 04 сиспользуют для рестриктного анализа, секвенирования по методу Сэнгера (пример 7) и для дальнейших генноинженерн ых мани пуля ций (примеры 8,9),П р и м е р 7. Секвенирование методом Сэнгера.Денатурацию плаэмидной ДНК осуществляют прибавлением 2 мкл в МаОН к раствору 4 мкг плазмидной ДНК в 20 мкл воды и инкубирование в течение 5 мин при комнатной температуре, После завершения инкубации прибавляют б мкл 7,5 М ацетата аммония для нейтрализации щелочи, перемешивают, прибавляют 100 мкл этанола, вновь перемешивают и замораживают в жидком азоте, Осадок ДНК собирают центрифугированием в течение 10 мин при 14000 об/мин, промывают 80 этанолом и высушивают в вакуумном эксикаторе. Растворяют осадок в 6 мкл воды, прибавляют 1 мкл буфера, содержащего 500 мМ Трис-НС 1 (рН 8,0), 100 мМ М 9 С 12 и 1 мкл праймера с концентрацией 0,2 ое/мл, Отжиг проводят 15 мин при 56 С. После завершения отжига в пробирку добавляют 2 мкл смеси, содержащей 25 мк КиР)сАТР и 1,5 ед фрагмента Кленова, аликвоты по 2,5 мкл переносят в пробирки с предварительно внесенными в них 2 мкл аликвотами терминирующих смесей и инкубируют 15 мин при 37 С. В пробы прибавляют по 1 мкл формамидной краски, прогревают 10 мин при 95 С и наносят пробу на структурный гель, Радиоавтограф экс- понируют на рентгеновскую пленку РМ-В.П р и м е р 8, Получение рекомбинантной ДНК, содержащей фрагмент(аЬ) и Рзт 1-Крп 1 фрагмент вектора рОС 19 (рРСО 4 аЬ).Рекомбинантную ДНК рРСО 4 Ьрасщепляют рестриктазами В 9111 и ЕсоБ 1 и выделяют электрофорезом в ПААГ фрагмент длиной 177 п.о. Выделенный фрагмент смешивают с векторной ДНК, полученной расщеплением рРС 04 а, этими же рестриктаэами и очищенной электрофорезом в 1 а гарозном геле, в 20 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-НС (рН 7,5), 10 мМ М 9 С 12, 20 мМ ОТТ, 1 мМ спермидин, 1 мМ АТФ, 50 мкг/мл БСА, прибавляют ДНК-лигазу фага Т 4 (2,5 ед) и инкубируют при 15 оС в течение 16 ч. В качестве контроля лигируют векторную ДНК на себя. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки Е.со ЛМ 103 и высевают на чашки с ампициллином. В опыте получают 8-кратное превышение количества клонов над контролем, Наличие клонированного фоагмента выявляют рестриктным анализом плаэмид, выделенных из полученных клонов (пример б), а структуру стыка подтверждают секвенированием (пример 7).П р и м е р 9. Получение рекомбинантной ДНК, содержащей фрагмент(аЬс) и Нпс 11- Есой 1 фрагмент вектора М 13 пр 18 (М 13 С 04 аЬс).Рекомбинантную ДНК рРС 04 аЬсрасщепляют рестриктазами Нпб 11 и ЕсоВ 1 и выделяют электрофорезом в ПААГ фрагмент длиной 599 п,о. После этого данный фрагмент смешивают с векторной ДН К, полученной расщеплением РФ-ДНК фага М 13 вр 18 этими же рестриктазами и очищенной от короткого фрагмента линкера электрофорезом в 1 Оага разном геле, в 20 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-НС (рН 7,5), 10 мМ МдС 12, 20 мМ ОТТ, 1 мМ спермидин, 11761808 12 Формула изобретения а+в Ь+пс,тсаттдлслдляттяттстяаятддлддляяталслстяттаддсталсттяслстлсятлясллпятттсдлсллядсссдттттттссдстаталсддсттялстядлсатад Бстт.".тслялллдлдтстлтссдяттссдстяялллддстст длОРйдтсдлддтсста сяллллатсггттттдялтлаятсддяятадсстттттададттаатстдаттттдаадс аятллссля спстттсстадстлддаатссатстдддстаддсадссасястадстст ССдттцятсС яяддЛаадетадтттССдаяСЛадтттадсттяСТаяСясядСТадад далладтстятсадсатдстсттстлядсляста нуклеотидная оследонательность Ь: ялтстстатааялссдяяатлдсттсссасталтсдтсдлдддсстялсатстдядядсдссстяятсссдттаддаяасядстдятдятттттаядс ллллтсзлладстсталсдсттдслтстасаддаттаддалссдядддяддадляттсда ттттлясттстялялстатяддтятдалсасттсддсттстаатстттсттсттсддятс стястяяттттсаятстядстастлдстстядслстсдсстястасдаятсялсатдсалсадссддддассладсталсадгтяладстатадатяядсалсатссдяста мМ АТФ, 50 мкгlмл БСА, прибавляют ДНК- лигазу фага Т 4 (2,5 ед) и инкубируют при 15 ОС в течение 16 ч, Полученной смесью трансформируют компетентные клетки Е,соИ 3 М 103, которые затем высевают в полужидкий агар на индикаторные чашки, содержащие Х-Оа и РТ 6, Получают 5-кратное превышение количества бесцветных бляшек над окрашенными, Наличие клонированного фрагмента выявляют рестриктным анализом РФ-ДНК, выделенных из полученных клонов.Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет получать синтетическую ДНК, кодирующую часть поверхностного белка СО 4 Т-лимфоцитов человека, ответственную за связывание с гликопротеином ор 120 ВИЧ и ее фрагменты, отличающиеся оптимизированным для Е,соИ кодоновым составом, а также рекомбинантные ДН К, содержащие зти синтетические ДНК и фрагмент вектора,Фрагмент ДНК, кодирующий часть поверхностного белка СО 4 Т-лимфоцитов че ловека, ответственную за связывание спротеином ор 120 вируса иммунодефицита человека, полученный в результате твердофаэного синтеза амидофосфитным методом с последующей ферментативной сборкой, 10 имеющий следующую нуклеотидную последовательность: 15 где ,е,п принимают следующие значения:1=1, п=О, в=О, 1=1, п=1, гп=О,1=1, п=1, 63 1 1 0 и 11 пч Оу1=0, п=О, п=1нуклеотидная последовательность а:2017 б 1808 ТССТЯСЛБИЛСЛЯТСТСТОЛСТСТБАСТСТБЯЛЛТСТСССССБЯЯТТСТТСТСЛСБТЛЫЫЛСЯТСССЛЯТСАЯАЯАСТБАБАСТБАБАССТТАБАББЯЯЯСССААЯААЯАЯБСБТТ АБТГССЯСТСТССЯСБСЯЯТАААААСАТССАББЯТЯБТААААСТСТБТСТЯТТЛБЛСАЛБТСЛСБЯСЫЛЯАЯБСБСЯССАТТТТТЯТАББТСССАССАТТТТЯЛЯАСАБА ТСТСЛЯСТЯЯАЛСТБСЛЛБАСТСТББТАСТТЯБАСТТБСАСТЯТТСТБСААЛАССЛБЛАА АБЛЯТСЯЛССТТЯАСЯТТСТЯАБАССАТЯААССТБААСЯТБАСААЯАСБТТТТЯБТСТТТ АЛАБТТЯАЫПСАЛААТСБЛТАТСБТТЯТТСТЯЫСТТТССАЯАААЯССТСАТСЯАТТБТС ТТТСЛЛ),ТСЛЛЯТТ Т Т АБСТ СТ АБСААСААБАССБАААЯБТСТТТСЯБАБТ АЯСТ ААСАЯ18171761808ТССТТ ААСАААСТТСТТСТСССТААААААССТСАСАСТСТТСААСТСАСТТССАСТ АССТАССАА ТТСТТТСААСААСАСССАТТТТТТССАСТСТСАСААСТТСАСТСАЛССТСА ССТТСТСАСААААААТСТАТССАСТТССАСТССАААААСТСТААССАСАТСААААТССТС ССААСАСТСТТТТТТАСАТАССТСААССТСАССТТТТТСАСАТТССТСТАСТТТТАССАСССТААССАСССТТСТТТССТСАСТАААССТСССТСТАААСТСААССАССССССТСАСТСТ ССАТТССТСССААСАААССАСТСАТТТССАСССАСАТТТСАСТТССТССССССАСТСАСААСААСАТСТСТСТСССАССАСССТААСТТСССССТСАТСАТСАААААССТСААААТССАА ТСТТСТАСАСАСАСССТССТСССАТТСААСССССАСТАСТАСТТТТТССАСТТТТАССТТСАСТСТСАСАСТТАСАТСТСССААСТТСААСАССАСАААСААСААСТТСАССТССТССТТ СТСАСАСТСТСААТСТАСАСССТТСААСТТСТССТСТТТСТТСТТСААСТССАССАССААТТСССТСТСАСТССТААСТСТСАСАСТСАССТССТССАС СТССАССТАСААСССАСАСТСАССАТТСАСАСТСТСАСТССАССАСТТС САССТС