Способ выделения полинуклеотидфосфорилазы

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ а 1 МЩ(ф Ф%)е цн, (к(.ф аМОТЮ э ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕТЕЛЬСТВУ ВТОРСКОМ(71) Специальное конструнологическое бюро биологных веществ и Институт цгенетики СО .АН СССР978,Б рга ЛИ 1 сМа ок в дре6, М ОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ П РИЛАЗЫ из Евсее й разрушение кле зоксирибонуклеаз щтови(56) 1Рог 3.е Трапу М.Х., 6 г З.В 1 осйев, 1972, 1)госоцг Трапу М.М. Ецг 82, 355,3, Кумарев ническая химия (54) (57) 1. С 11 НУКЛЕОТИДФОСФО со 11,включающи присутствии де 3(5 Ц С 12 Н 9/14; С 12 Н 1/19 отделение бесклеточного экстракта, хроматографию его на диэтиламиноэтил. целлюлозе, концентрирование фермента в полученном элюате сульфатом аммония и сорбцию полинуклеотидфосфори.лазы на сорбенте с последующей элюцией, повторным концентрированием фермента в элюате с помощью сульфата аммония и гельфильтрацией, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве сор- бента используют альдегидосилохром, ковалентно связанный с лигандом - красителем процион ярко-голубой М- причем сорбцию-Фермента ведут в среде буфера рН 8,9-9,1, содержащего 0,9-1,1 М КС 8 и 5-15 мМ МССР, а элюцию осуществляют бессолевым буфером рН 8,9-9,1.2. Способ по и. 1, о т л и ч а юи й с я . тем, что разрушение клек проводят лизоцимом в присутсти Тритона Х.Нсн-сн,-Н,-0ЮН О ЫН Изобретение относится к биохимии,а именно к способам получения высокоочищенных ферментов, и может бытьиспользовано для выделения и очисткиполинуклеотидфосфорилазы (ПНФазы)с последующим применением ферментадля синтеза высокомолекулярных гомон гетерополирибонуклеотидов и рядадругих биохимических исследований,Полинуклеотидфосфорилаза являетсяключевым звеном работ по получению 10двухспиральных комплексов полирибонуклеотидов, являющихся наиболееэффективными невирусными индукторами.интерферона,Известен ряд способов получения 15высокоочищенной полинуклеотидфосфорилазы, пригодной для иммобилиза"ции и синтеза высокомолекулярныхполирибонуклеотидов. Большинствоэтих способов основано на использовании хроматографии на ионообменныхсорбентах, гель-фильтрации, солевогофракционирования .белков, высокоскоростного центрифугирования и незначительно различаютсямежду собой. . 25Известен способ выделения полинуклеотидфосфорилазы, включающий следующие последовательные стадии: получение грубого экстракта биомассыЕзсйег 1 сМа со 11 В денатурациюпримесных белков прогреванием экстракта, удаление нуклеоновых кислотфракционированием на ДЗАЭ-целлюлозе,концентрирование белка сульфатомаммония, фракционирование ферментасульфатом аммония, удаление сульфата аммония дйализом, хроматографиюфермента на ДЭАЭ-сефадексе А,концентрирование фермента сульфатомаммония, гель-фильтрацию на сефадексе Г, концентрирование ультра- . 40фильтрацией на фильтрах ХМ(1( .Данный способ дает очистку в 210280 раз. Основным недостатком способа является многостадийность и длительность процесса очистки. 45Наиболее близким к предлагаемомуявляется способ выделения полинуклеотидфосфорилазы из Езспег 1 сп 1 асо 11, включающий разрушение клетокпутем растирания с окисью алюминия 5с последующей обработкой дезоксирибонуклеазой, отделение бесклеточного экстракта, высокоскоростное цент рифугирование при 100000 у, фракционирование его хроматографией надиэтиламиноэтилцеллюлозе, концент 55рирование фермента в элюате сульфатом аммония, фракционирование белков сульфатом аммония, диализ, сорбцию фермента на диэтиламиноэтилсефадексе Апри рН 7,5 в градиенте ИаС 1 с последующей элюацией, концентрирование сульфатом аммония и гель-фильтрацией, после чего проводят концентрирование ультрафильтрацией и аффинную хроматографию на голубой декстран-сефарозе в градиенте концентрации КСР (0-1,0 М) или поли (И) (0,1 мкМ) 2 .Указанный способ является многостадийным и трудоемким, Кроме того, недостатком является использование аффинной хроматографии Фермента, уже имеющего высокую степень чистоты (удельная активность ПНФазы 700 ед.акт./мг) . Это не позволяет реализовать преимущества метода аффинной хроматографии для очистки ферментаКроме того, голубая декст ран-сефароза и ВгСМ-сефароза, используемая для получения,аффинного сорбента являются труднодоступными импортными реактивами, а использование полиинозиновой кислоты для элюции фермента с голубой декстран-сефарозы требует проведения дополнительных стадий очистки фермента от полинуклеотида, который загрязняет препараты.Цель изобретения в .упрощение способа получения полинуклеотидфосфорилазы.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения полинуклеотидфосфорилазы из Езспег 1 сМа со 11, включающему разрушение клеток в присутствии дезоксирибонуклеазы, отделение бесклеточного экстракта, хроматографию его на диэтиламиноэтилцеллюлозе, концентрирование фермента в полученном элюате сульфатом аммония и сорбцию полинуклеотидфосфорилазы на сорбенте с последующей элюцией, повторным концентрированием фермента в элюате с помощьв сульфата аммония и гельфильтрацией, в качестве сорбента используют альдегидосилохром, ковалентно связанный с лигандом - красителем процион ярко-голубой М-В, причем сорбцию Фермента ведут в среде буфера рН 8,9-9,1, содержащего 0,9-1,1 М КС 6 и 5-15 мМ МдС 1, а элюцию осуществляют бессолевым буфером рН 8,9-9,1.Обычно разрушение клеток проводят лизоцимом в приоутствии Тритона Х,Используемый в качестве сорбента процион-силохром имеет формулуи содержит в качестве лиганда ковалентно связанный с альдегидосилохромом остаток красителяпроциона яркоголубого М-, структурного аналогацибакрона ЗС - А, Связь между красителем и матрицей осуществляетсячерез 3,3-диаминобензидиновый мостик.Использование в качестве аффинногосорбента процион-силохрома позволяетпроводить сорбцию полинуклеотидфосфорилазы в присутствии 0,9-1,1 М 10КС 6 и 5-15 мМ МдС 2 при рй 8,9-9,1,а элюцию вести,при том же рН в отсутстВии КС 8 и МдСВ . В этих условиях отделение основной части балластных белков происходит, уже при 15нанесении образца на аффинный сорбент. Выбранные условия хроматографии на аффинном сорбенте значительно сокращают время ее проведенияи упрощают аппаратурное оформлениестадии.Способ осуществляют следующимобразом,Клетки Е. со 11 МРЕразрушаютлизоцимом в присутствии ТритонаХи панкреатической ДНКазы, необходимой для гидролиза освобождающейся ДНК и, как следствие, дляуменьшения вязкости раствора, чтооблегчает дальнейшее проведениеочистки, Полученный грубый экстрактнаносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозойи элюируют фермент 0,15 М КС 1 . Изфракции, содержащих фермент, осаждают белок добавлением сухого сульфата аммония до степени повышения 350,6-0,8. После растворения ферментнаносят на колонку с процион-силохромом в.присутствии 0,9-1,1 М КС 1и 5-15 мМ МцС 0, что обеспечиваетудаление балластных белков. Элюцию 40фермента осуществляют при рН 8,99,1 бессолевым буфером, содержащим50 мИ трис-НСГ у 0,5 мМ ЭДТАу 0,2 мМДТЭ; 5 глицерина,После элюции фермента его можно 45концентрировать сульфатом аммония ифракционировать на биогеле А 1,5 М.фермент, полученный на этой стадии,может быть использован для синтезаполирибонуклеотидов без дополнительной обработки.Получаемый по предлагаемому способу фермент имеет 240-кратную очистку и удельную ,активность470 ед, акт./мг, Фермент электрофоретически гомогенен,П р и м е р 1, Получение аффинного сорбента.Для получения аффинного сорбентаиспользуют альдегидосилохром, синтезированный по методу 3,. с использовснием широкопористого силохромаС.Суспензию 1 г альдегидосилохромав 7-10 мл НО обрабатывают 20 мкмоль3,3-диаминобензидина при 80-90 фС в течение 30 мин. После охлаждения суспензии и отмывки водой добавляют 20 мкмоль проциона ярко-голубого М-В и выдерживают смесь в течение 30 мин, затем добавляют ВаСО 3 до конечной концентрации 20 мг/мл и вы-. держивают 30 мин при 60 фС. Полученный сорбент помещают в хроматографическую колонку и промывают форма- мидомД М КС 1 и водой до отсутствия оптической плотности на выходе с колонки.П р им е р 2. Выделение и очистка полинуклеотидфосфорилазы.Получение голубого экстракта,К суспензии 25 г биомассы Е.со 13. МРЕв 75 мл 50 мМ трис-НСО (рН 8,0), 10 мМ МдСО, 0,5 мМ ЭДТА, 0,2 мИ ДТЭ, 5 глицерина (буфер ТМЭ) добавляют 20 мг лизоцима (марка Б, Олайне) и инкубируют на ледяной бане в течение 15 минПосле добавления 0,1 мл Тритона Хи дополнительной инкубации в течение 30 мин добавляют 25 мкл панкреатической ДНКазы (10 мг/мл) и инкубируют еще 30 мин. После центрифугирования при ОС в течение 60 мин при 5000 об/мин осадок отбрасывают, а суспернатант (грубый экстракт) используют для выделения фермента.Фракционирование на ДЭАЭ-целлюлозе.Грубый экстракт наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (Олайне) объемом л 170 мл, уравновешенную ТМЭ-буфе- роМ, рН 8,0 со скоростью 50 мл/ч. После нанесения колонку промывают тем же буфером до отсутствия оптической плотности в элюате. Фермент с колонки элюируют 0,15 М КСР в ТМЭ-буфере при рН 8,0. К полученному элюату (".750 мл) добавляют сухой (ИН 4) БО 4 до степени насыщения 0,6. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин.Фракционирование на процион-силохроме.Осадок белков растворяют в ТМЭ- буфере (рН 9,0), содержащем 1 М КСР, полученный раствор наносят на колонку с аффинным сорбентом объемом 20 мл со скоростью 40 мл/ч. После нанесения колонку промывают. тем же буфером до отсутствия оптической плотности в элюате. ПНфазу элюируют бессолевым буфером, содержащим 50 мМ трис-НСР (рН 9,0), 0,5 мМ ЭДТА, 0,2 мМ ДТЭ, 5 глицерина. Фракции, содержащие фермент, объединяют и концентрируют полинуклеотидфосфорилазу добавлением сухого (ИН 4)2 804 до степени насыщения .0,6.На этой стадии достигается значительная очистка фермента из практи. чески нефракционированного грубого экстракта - не менее чем в 14 раз,.,ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Заказ 651/23 филиал ППП ффПатент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Фракционирование на биогеле А 1,5 М.Осадок фермента растворяют в 0,5 мл ТМЭ-буфера (рН 8,0) и наносят полученный раствор на колонку с биогелем А 1,5 М (15 мл)Фракции, содержащие фермент, объединяют и до использования хранят при -20 ОС без какой-либо дополнительной обработки.На стадии достигается дополнительная очистка фермента (до б раз) и перевод в буфер необходимого состава.Полученный по предлагаемому спо.собу фермент при электрофорезе 5 мкг в денатурирующих условиях гомогенен, 15 имеет удельную активность470 ед. акт,/мг при степени очистки 240Активность фермента на всех стадиях определяют по включению (С 1 Ч ): АМФ в кислотонврастваримый продукт. Реакцию проводят при 37 фС в присутствии 25 мМ АДФ, 10 мМ МдС 8 1 мМ ЭДТА 0,15 М трис-НСД (рН 8,0). За единицу активности принимают количество. фермента, катализирующее включение 1 мкмоль АМФ .в полимер в течение 1 ч в выбранных условиях.Использование предлагаемого способа очистки полинуклеотидфосфорилазы по сравнению с известным позволяет упростить процесс очисткй ПНфазы путем сокращения количества стадий с одиннадцати до шести и использования более технологического метода разрушения биомассы по сравнению с растиранием с АООЗ . При этом исклю чаются нетехнологические стадии высокоскоростного ультрацентрифугирования, ультрафильтрации и диализа и малоэффективная стадия фракционирования сульфатом аммония, а также стадий хроматографического разделения белков с применением градиентного элюированияКроме того, процесс упрощается за счет применения стадии аффинной хроматографии для очистки ПНФаэы из практически нефракционированного (по белку) грубого экстракта клеток и многократного использования аффинного сорбента.