Штамм бактерий кlевsiеllа рnеuмоniае-продуцент рестриктазы кр 378 1

/20 51)5 С 12 ЕТЕНИЯ ТОРСКОМУ С ТЕЛЬ ТВУ Морфологичвиде укороченнформы, неподвграмотрицателкапсулу, длина ися от 0,5 до 7 мветственно,единично, пара отных авило, и, неризнак бразуе естящ тся кол овного розра конси.Нап , как пр е колон онии от очные елкие типа -мные, от ичаю- колоте ОСУДАР СТ В Е ННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗО(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ(56) Яап А,А., ЯТе рЬепз й, Е., Агп Ьгоз 1 о Я, М.,Наг 1 К,Ч 1, А зес 1 непсе зресбс епс 1 описеазегоп) Мсгососснз гасоснгапз - Вос). апбВ 1 орЬ. Асса, 1982, 697, р. 178-184.Патент США К. 4688631,кл, С 12 М 9/22, 1987.(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ К ЕВЯ 1 Е 11 АРВЕ.1 МОМ 1 АЕ - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ Крп 378 1,Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению рестриктазы, способной узнавать ирасщеплять последовательность нуклеотидов ССОСОО,Целью изобретения является выявление штамма КеЬз 1 еПа рпенп)опае ВКПМ В 4894 (378), нетребовательного кпитательным средам, обеспечивающего более высокий выход рестриктазы, способнойузнавать и расщеплять последовательностьнуклеотидов ССОСОО,Штамм К 1 еЬз 1 еИа рпенгпоп 1 ае 378 выделен из воздуха в результате поиска штаммов- продуцентов рестриктаз.Штамм К 1 еЬз 1 еПа рпенгпоп 1 ае 378 характеризуется следующими признаками.(57) Изобретение относится к биотехнологии и енной инженерии, Целью изобретения является выявление штамма К 1 еЬз 1 е 1 а рпенгпопае ВКПМ В(378), нетребовательного к питательным средам, обеспечивающего более высокий выход рестриктаэы, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов ССОСОО. Штамм получен в результате поиска продуцентов рестриктаз, выделен из воздуха, растет на простой дешевой питательной среде отечественного производства, обеспечивает повышенный выход рестриктазы при более простом экономичном способе выделения фермента по сравнению с известным, Из 1 г влажной биомассы выделяют 40000 ед, акт, фермента с активностью 30000 ед, акт,/мл. еские признаки. Клетки в ых палочек часто овальной ижные споры не образуют ные, как правило имеют толщина клеток колеблюткм и от 0,3 до 1,5 мкм соотрасполагаются клетки ми, редко цепочками. Культуральные и питательных средах о белесые, выпуклые, б прозрачные, встречаю по морфологии от осн суховатые, крупные щиеся друг от друга нии, 1659480Оптимальная температура роста штамма 30 - 37 С, предел от 12 до 43 С, оптимум рН 7,2.Физиолого-биохимические признаки, Штамм КеЬзеа рпеовопае 378 отличает высокая биохимическая активность: усваивает глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу, дульцит, рамнозу, ксилоэу, мальтозу, сорбит, арабинозу, рафиноэу, глицерин, крахмал; восстанавливает нитраты, положителен по каталазе, лизиндекарбоксилазе, в реакции Фогес-Проскауэра; усваивает малонат, цитрат; не выделяет индол, сероводород; отрицателен по уреазе, орнитиндекарбоксилазе, аргининдегидролазе, в реакции с метиловым красным, по оксидазе, не разжижает желатин. Соотношение Г+ Ц 55,4 моль..Штамм КеЬзеа рпешпопае 378 обладает устойчивостью к пенициллину, эритромицину, олеандомицину, оксациллину, ристомицину, сульфатиазолу, менкомицину, чувствителен к тетрациклину, стрептомицину, мономицину, неомицину, левомицетину, канамицину, полимиксину, ампициллину, гентамицину, рифампицину, слабо чувствителен к карбенициллину.Штамм хранится в жидкой питательной среде с добавлением глицерина до 15 фпри минус 60 С.Продуцируемая предлагаемым штаммом рестриктаза Крп 378 1 характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов ССОССО; оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5 - 8,5; для проявления активности рестриктазы требуются ионы М 9, оптимальная концентраг+ция 10 мМ, оптимальная концентрация йаС в реакционной смеси 50-70 мМ; оптимальная температура 37 С.Для поддержания штамма КеЬзеа Р 378 используют рыбный питательный агар (РПА).Для культивирования и ферментации К, рпецаопае 378 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды;Пептон 10 Дрожжевой экстракт 5 МаС 5 Глюкоза добавляется перед засевом до 1 о Культивирование проводят при 30 С с хорошей аэрацией (200 об/мин) на качалке в течение 15-16 ч.Выход биомассы: 8-12 г/л культуральной жидкости,Выходрестриктазы Крп 3781:40000 ед,акт/г биомассы,П р и м е р, Культивирование штамма иполучение биомассы,Клетки КеЬзеа рпеипопае 378 размораживают при 37 С и высевают в жид 5 кую питательную среду, содержащуюпептон (10 г), экстракт (5 г), йаС (5 г) идистиллированную воду до 1 л. Глюкозу добавляют перед засевом до 1 , После 24 чинкубирования в термостате при 30 С10 штамм высевают на плотную среду с РПАдля получения отдельных колоний, Выращивают при тех же условиях. Выросшие клеткипереносят петлей с агара в колбы с 50 млжидкой питательной среды для получения15 инокулята, Инкубируют на качалке (200 -220 об/мин) 24 ч при 30 С.Полученным инокулятом засевают объем среды (качалочные колбы по 250 мл среды), предназначенный для ферментации, из20 расчета 1,0 мл инокулята (стационарнойкультуры) на 100 мл среды. Инкубируют притех же условиях в течение 20 ч, После охлаждения клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин, Выход биомассы 9 г25 влажных клеток на 1 л среды.Выделение и очистка рестриктазы.4 г клеток суспендируют в 10 мл буфераА, содержащего 10 мМ трис-НС, рН 7,6,10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1 мМ ЭДТА, и30 разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 40 мин при 2 С).Надосадочную жидкость собирают, добавляют к ней 2 М КС до конечной концентра 35 ции 0,1 М и 10 -ный полиэтиленимин доконечной концентрации 0,1 ф . Смесь тщательно перемешивают и выдерживают, вольду в течение 30 мин, затем центрифугируют (6000 об/мин, 10 мин при 2 С). Надоса 40 дочную жидкость отбирают и.добавляютсульфат аммония до 70 -ного насыщения(при перемешивании на магнитной мешалке), Смесь выдерживают во льду втечение 30 мин, затем центрифугируют45 (6000 об/мин, 10 мин при 2 С), Супернатантотбрасывают, осадок растворяют в 10 млбуфера А и диализуют против 300 мл буфераА в течение 2 ч; Далее раствор белков наносят на колонку (2 х 20 см) с ДЕАЕ-целлюло.50 зой (ДЕ) и промывают буфером А доисчезновения УФ-поглощающего материа-ла в элюате, Адсорбированный материалэлюируют 400 мл линейного градиента КС(0-0,8 М) в буфере А. Аликвоты из каждой55 фракции(по 2 мкл) анализируют на содержание рестриктаэы, инкубируя 30 мин при37 С с 1 мкг ДНК фага Л,и анализируютэлектрофорезом в геле агарозы. Фракции,содержащие фермент, обьединяют (общийобьем 30 мл) и наносят на колонку (1,2 х 5 см)1659480 Полученный ферментный препарат свободен от значительных примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаэ. При инкубации 120 ед. акт. фермента с 1 мкгДНК фага Л в течение 2 ч при 37 С наблюдается стандартный набор фрагментов ДНК. При Составитель И. ПриваловаРедактор Л. Веселовская Техред М.Моргентал Корректор Н. Король Заказ 1821 Тираж 376 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 с гидроксилапатитом. Колонку промывают буфером Б, содержащим 10 мМ фосфата калия, рН 7,6, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,1 мМ ЭДТА, до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате, Адсорбированный материал элюируют 150 мл линейного градиента фосфата калия, рН 7,6 (0,01-0,6 М) в буфере Б. Аликвоты из каждой фракции (по 2 мкл) анализируют на содержание рестриктазы. Фракции, содержащие рестриктазу Крп 378 1, объединяют (общий объем 15 мл) и диализуют в течение 16 ч против 150 мл буфера А, содержащего 50- ный глицерин, и хранят при -20 С.Выход продукта 40000 ед.акт. на 1 г биомассы. Полученный препарат имеет концентрацию 30000 ед,акт./мл.Активность фермента определяют в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис-НО, рН 8,0, 10 мМ М 9 С 2, 50 мМ чаС, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мкг ДНК фага Л при 37 С. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага Л за 1 ч при 37 С,инкубации 5 ед.акт, фермента с 1 мкг ДНК фага Л в течение 1 ч при 37 С фрагменты ДНК сшиваются ДНК-лигазой и повторно гидролизуются рестриктазой Крп 378 1.5 Для определения последовательностинуклеотидов узнаваемой рестриктаэой Крп 378 1 проводят гидролиз ДНК фага Лрестриктаэами Крп 378 1 и Явт , а также совместный гидролиэ этими рестриктаэами, 10 Наблюдаемая картина полного совпа- дения фрагментов, полученных при гидро- лизе ДНК рестриктазами Крп 378 1 и Яз 1порознь и совместно, указывает на то, что рестриктаза Крп 378 1 является изошизоме ром рестриктазы Язт, узнает и расщепляетпоследовательность нуклеотидов СССС 66,Полученный штамм по сравнению сизвестным обеспечивает повышенный выход целевого фермента, составляющий 20 40000 ед.акт/г биомассы.Для культивирования предлагаемогоштамма используется простая среда из доступных компонентов.Поскольку рестриктаза Крп 378 1 имеет 25 сайт узнавания ССОС 86, идентичный сайтуузнавания Язти известного, она может заменить эти рестриктазы во всех генно-инженерных работах. 30 Формула изобретенияШтамм бактерий КеЬзеа рпецвопаеВКПМ В- продуцент рестриктазы Крп378 1,