Способ получения фосфолипазы

О П И С А Н И Е р 644827ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ СОюз Советбйид Социалистических Реслублик(22) Заявлено 25.06,76 (21) 2378165/2812 Р 1 присоединением зая Государствеииый комитет СССР ио делам изсоретеиий и открытий(53) УДК 576,8(08 45) Дата опубликова описания 30(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЬ Изобретение относится к технике производства ферментов, в частности полученияфосфолипазы, и может быть использованов микробиологической промышленности,Известен способ получения фосфолипазы 5путем культивирования микроорганизмоврода Вас 111 цз на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделениемфермента из культуральной жидкости,11. 10Этот известный способ является наиболее близким к предложенному изобретениюпо технической сущности и достигаемомурезультату,Выход фермента и его качество по известному способу недостаточно высоки,подготовка питательной среды для культивирования требует различных режимов стерилизации входящих в нее компонентов.Кроме того, основные компоненты питательной среды для культивирования микроорганизмов рода Вас 111 цз являются дефицитными и дорогостоящими, а их хранениесвязано с затруднениями, так как требуетнизких температур, что отражается на стонмости целевого продукта.Цель изобретения - повышение выходацелевого продукта и улучшение его качества,Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе получения фосфолипазы из микроорганизмов рода Вас 111 цз используют штамм Вас 11 цз зцЫйз 6-22.Способ осуществляют следующим образом,Микроорганизмы штамма Вас 111 цз зцЫ 1- 11 з 6-22 культивируют на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и необходимые минеральные соли при следующем соотношении компонентов, г/л; ферментативный крахмал 170, кукурузный экстракт 11,4, пивные дрожжи 2,3, лактоза 2,9, (ИН 4)НРО 48,4, ЫаС 10,29, Мф 040,14, Ке 504 2,9, СаС 1, 1,1, УпС 12 0,14.Стерилизацию компонентов питательной среды проводят при одном режиме стерилизации 20 мин при 1,2 атм и 123 С. В процессе культивирования осуществляют аэрацию при количестве подаваемого воздуха 0,17 м/мамин, рН поддерживают в интервале 6,0 - 8,0 25 о/о-ным раствором аммиачной воды или концентрированной фосфорной кислотой.Затем фермент выделяют из культуральной жидкости.П р и м е р 1. Лабораторные опыты для получения фосфолипазы из бактерии рода Вас 111 цз вида зцЬИ 11 з штамма бпроводят при последовательности операций: поддержка посевного материала в пробирках,культивирование Вас 111 цз зцЬЫз шт. 6-22в колбах.Культуру Вас 1 цз зцЫ 11 з штамм 6-22 5поддерживают и консервируют на ломтикахкартофеля в безкислородных средах- в про бирках Ру, пробуждают в стерильных условиях. Из пробирки вынимают резиновуюпробку, ватную, смоченную пирогаллолом 10и гидроокисью калия и сухую ватную пробку, которую заменяют стерильной ватнойпробкой, Затем культуру инкубируют при37 С 24 часа.После образования обильной пленки на 15картофеле культуру пересевают на свежийкартофель в пробирках. Ру инкубируют при37"С 24 часа.Оживленную культуру освобождают отвегетативных форм, для чего подготавливают солевой раствор состава (на 1 л):ИаС 1 8,5 г0,026%-ный раствор СаС 1 10 мл0,05%-ный раствор МдС 1, 10 млСолевой раствор разливают в пробирки емкостью 18 К 180 мм по 5 мл и стерилизуют20 мин при 1,2 атм и 123 С. Затем охлаждают до комнатной температуры и петлейпереносят часть пленки с картофеля в стерильный солевой раствор (соблюдается зостерильность),Суспензию культуры в солевом растворевыдерживают в кипящей водяной бане5 мин и после этого быстро охлаждают, После температурного шока, суспензию высевают на свежие ломтики картофеля. Выращивают 24 часа при 3 С. Пробирки хранят в холодильнике при 5 С или при комнатной температуре не более недели.Подготовленную культуру используют в 4 Окачестве инокулята при культивированииВас 111 цз зцЫ 11 з штамма йв колбах,Опыты проводят глубинным способом ваэробных условиях в Эрленмейеровскихколбах объемом 100 - 700 мл, в которые помещают 20 - 120 мл питательной среды.Культивируют на питательной среде состава, г/л: ферментированный крахмал 170,кукурузный экстракт 11,4, пивные дрожжи2,3, лактоза 2,9, (МН,) НР 04 8,4, МаС 1 5 О0,29, Мд 304 0,14, К 504 2,9, СаС 1 1,1,ЛпС 1 0,14.Крахмал предварительно ферментируют(осахаривают) следующим образом: к100 г крахмала приливают 200 мл воды и20 мл раствора бактериальной амилазы сактивностью 3 ед (АС)/мл (по колориметрическому методу), Суспензию тщательноразмешивают, клейстеризуют в водянойбане при 75 С. Оклейстеризованный крах Омал разжижают под влиянием бактериальной амилазы, Процесс ведут до образования эритродекстринов (красное окрашивание с йодом), Разжиженный крахмал охлаждают до комнатной температуры, сме 4шивают с раствором остальных компонентов и доводят рН до 7,3 25%-ным водным раствором аммиака,Готовую среду разливают в колбы и стерилизуют 20 мин при 1,2 атм и 123 С. 11 осле охлаждения до комнатной температуры осуществляют посев выше указанным инокулятом (соблюдается стерильность). Культивируют как в стационарных условиях так и при перемешивании на круговой качалке при 180 об/мин и 37 С. максимальное накопление фосфолипазы во всех случаях культивирования в колбах наблюдается от 15 до 35 часов. Продолжительное культивирование (до 48 - 50 часов) приводит к сильному уменьшению или полной потере накопленной фосфолипазной активности. Биосинтез фосфолипазы происходит как в стационарных, так и в условиях перемешивания, с некоторым преимуществом во втором случае. Полученная активность равна 60,0 тромбопластиновых ед/мл (по методу, описанному 01 паезз А. В. и соавторов в журналах Ас 1 а ражип ппсгоЬ 1 о 1, зсапй. том В 80, стр. 373, 1972 г, и Ецг. Д. В 1 осйегп том 2/, стр, 238, 1972 г,). Полученная наивысшая фосфолипазная активность при культивировании в колбах равна 86,7 тромбопластиновых ед/мл,Из проведенных опытов установлено, что продуцирование фосфолипазы бактериями Вас 1 цз зцЫз штамм 6-22 происходит в широком температурном интервале - от 30"С до 50 С, с некоторым преимуществом в интервале 37 С - 50 С (активность в среднем составляет 54,4 тромбопластиновых ед/мл) и в широком интервале рН - 5,0 - 9,0, с оптимумом при рН 7,5 (активность в среднем при рН 7,5 составляет 86,4 тромбопластиновых ед/мл). При ферментации в колбах бактерии предлагаемого вида хорошо адаптируются к условиям культивирования, что связано со стабильностью (по активности) получения фермента фосфолипазы. Из проведенных 86 ферментаций в колбах среднее значение фосфолипазной активности составляет 60,0 тромбопластиновых ед/мл.П р и м е р 2. Полупроизводственные опыты для получения фосфолипазы из бактерии рода Вас 1 цз вида зцЬШз штамма 6-22 проводят при последовательности операций; поддержка посевного материала в пробирках, выращивание посевного материала в колбах, культивирование Васцз зцЫ 111 з штамма б-бб в 20-л ферментерах,Поддержку культуры Вас 1 цз зцЫ 11 з штамма 6-22 в пробирках в качестве инокулята проводят в соответствии с примером 1,Культуру Вас 1 цз зцЫ 11 з штамма 6-22 для засева ферментеров выращивают в эрленмейеровских колбах на среде, содержащей, г/л: ферментированный крахмал 170,0, кукурузный экстракт 11,4, пивные дрожжи52,3, лактоза 2,9, двузамещенный фосфат аммония 8,4, натрий хлористый 0,29, магний сернокислый 0,14, калий сернокислый 2,9, кальций хлористый 1,1, цинк хлористый 0,14.Осахаривание крахмала проводят согласно примеру 1, Среду стерилизуют 20 минут при 1,2 атм, а затем охлаждают до комнатной температуры, рН среды доводят до 7,2 - 7,5 25%-ным водным раствором аммиака или концентрированной фосфорной кислотой,Колбы с питательной средой при соблюдении стерильности засевают с помощью петли кусочком пленки из рабочей пробирки с культурой, Засеянные колбы культивируют в условиях перемешивания на круговой качалке при 180 об/мин и 37 С в течение 24 часов, Подготовленная культура Вас 111 цз зцЫ 111 з штамма Стслужит в качестве инокулята для засева ферментера.Культивирование проводят в 20-л ферментере при коэффициенте заполнения 0,5. Для выращивания культуры Вас 111 цз зцЫ 1- 11 з штамма 6-22 готовят питательную среду того же состава, как и в Эрленмейеровских колбах. Среду стерилизуют 20 минут при 1,2 атм и 123 С, рН среды после стерилизации доводят концентрированной фосфорной кислотой до 7,0 - 7,5.Перед засевом питательную среду в ферментере продувают воздухом. После насыщения среды кислородом и установления температуры 37 С производят посев из расчета 200 мл микробной взвеси на 10 л среды, Культивирование проводят при 37 С и постоянной аэрации, при количестве пода 6448276ваемого воздуха, равном 0,17 м/м мин, рН во время ферментации поддерживают в интервале 6,0 - 8,0 путем добавления 25%-ного водного раствора аммиака или концент 5 рированной фосфорной кислоты.Максимальное накопление фосфолипазнаблюдается к 15 - 35 часам роста и составляет в среднем 97,0 тромбопластиновых ед./мл или 57,0 мг экв/мл. мнн (по методу, 10 описанному Хжаа 1 й. Р. А. и соавторов вжурнале В 1 ос 1 пт, е 1 Ь 1 ор 11 уз. ас 1 а, том 233, с. 474, 1971).Предлагаемый способ получения фосфолипазы по сравнению с известным техниче ским решением той же задачи позволяет повысить выход фермента примерно в пять раз, за счет чего снижается себестоимость продукции, с одновременным улучшением качества целевого продукта.20 Способ обеспечивает производство стабильной фосфолипазы (по активности).Формула изобретенияСпособ получения фосфолип азы путем25 культивирования микроорганизмов родаВас 111 цз на питательной среде, содержащейисточники углерода, азота и минеральныесоли с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, о т л и ч а 30 ющи йся тем, что, с целью повышениявыхода целевого фермента и улучшения егокачества, из микроорганизмов рода Вас 11- 1 цз используют штамм Вас 111 цз зцЫ 111 з 6-22.Источники информации,35 принятые во внимание при экспертизе1. Журнал Микробиология, т. 39,с. 465, 1970.Составитель А. БражннковаРедактор Н. Грязнова Техред Н. Строганова Корректор 3, ТарасоваЗаказ 2650 у 8 Изд Мо 124 Тираж 548 Подписное НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Типография, пр. Сапунова, 2