Штамм бактерий flаvовастеriuм аquатilе продуцент рестриктазы fau i

,1 бб 121 51)5 С 12 й 9/14, 1/20 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Новый штамм стематического по тов рестриктаз в и методикускрининг ной коллекции пр ыделен в результате сиска штаммов-продуценресной воде, используя а, и хранится во всесоюэмышленных микрооргаК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ"Вектор" и Лимнологический институт СОАН СССР(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ Г 1 АЧОВАСТЕВ 1 ОМ АООАТ 11 Е - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ ГАМ 1(57) Изобретение хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИГенетика под коллекционным ноИзобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм, которыйможет быть использован для получения рестриктазы Рап 1, способный узнавать непалиндромную последовательность нуклеотидов в составе ДНК5 - ССС 6 С 3 - 666 С 6-5Такая рестриктаза может быть применена в молекулярной биолОгии и генной инженерии как инструмент для вырезания структурных и регуляторных участков ДНК и является моделью для изучения белокнуклеиновых взаимодействий. мером В, получен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции в природных условиях. При культивировании штамма в свежей питательной среде (МПБ).при 25 С аэрацией два объема в минуту до достижения логарифмической фазы роста получают урожай клеток. Биомассу осаждают центрифугированием, деэинтегрируют ультразвуком и. подвергают хроматографической очистке. В результате получают рестриктазу Рап 1, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 - ССС 6 С, 3 -666 С 6-5, Рестриктаза данной специфичности является новым объектом, ее используют в генной инженерии и молекулярной биологии. 1 табл. ниэмов ВНИИ генетика, коллекционный номер В,ваайШтамм ЕачоЬастегйа ас 1 ца 01 е ВОс, характеризуется следующими признаками. О Морфологические признаки, Клетки .неподвижные, грамотрицател ьные палочки. Размеры 1-2 мкм длиной, 0,5 - 0,7 мкм шириной. Иногда образуют нити длиною до 6 мкм, Спор не образуют. Сд Жгутики не обнаруживаются. Колонии бледно-оранжевые, гладкие, блестящие, выпуклые с ровными краями,аей Физиологические признаки,. Каталазоположительный, оксидаэоположительный. Азроб. Аэробно использует глюкозу без образования газа и кислоты, Реакция Фогес-Проскауэра отрицателъная, В анаэробных условиях брожение глюкозы и рост отсутствует. Гидролизует желатин, но не целлюлозу и крахмал. Восстанавливает50;-ный глицерин 10 15 20 25 30 35 5 -ССС 6 С40 45 50 55 нитраты в нитриты. Индолположительный.В аэробных условиях медленно образуеткислоту из мальтозы, маннозы, арабинозы,сахароэы, но не глюкозы, рамнозы, дульцита, маннита, лактозы, сорбита, инозита, глицерина и спирта. Чувствителен кэмпициллину, тетрациклину, стрептомицину, Устойчив к хлорамениколу, канэмицину.Доли 6 С в ДНК - 33 О (по плавучей плотности).Культуральные свойства,Дает рост на твердых и жидких питательных средах на основе мясопептонного5 ульона. В жидкой среде без встряхиванияЬбразует равномерную нить. ОбнаруживаЬтся рост при 15 - 30 С, Оптимальной дляЬоста является 25-30 С. Наблюдается ростпри концентрациях КаС 0 - 1,5 О/ оптимальные значения 0-0,7 О. Оптимальными являются нейтральные значения рН. При рН 5 и9 роста не обнаруживается.Дает активный рост на бульоне Хоттинегра. Требователен к аэрации.Хранение штамма осуществляют подваэелиновым маслом в ЗОО-ном глицеринепри -70 С,Штамм Е,ароайе Всодержит уникальную рестриктазу с ранее неизвестнойспецифичностьо5 -ССС 6 С 3 -666 С 6-5Изобретение иллюстрируется следующими примерами,П р и м е р, Получение биомассы и выделение фермента,Ночную культура Е,/азиате засевают всвежую питательную среду МПБ. Культивируют при 25 С с аэрацией два объема вминуту при 2000 об/мин мешалки до достижения средней логарифмической фазы роста. Клетки осаждают центрифугированиемпри 4 С, Осадок оранжевый, рыхлый. Выход биомассы 1,4 г/л культуральной жидкости, 10 г клеток суспензируют в 50 мл 0,02М трис- НО буфера, рН 7,5, содержащего1 х 10 М ф-меркаптоэтанол и 0,1 О тритонХ, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (12000 хо, 30 мин) инадосадочную жидкость наносят на колонкус фосфоцеллюлозой (Р, ЯЬатгпап) объемом 30 мл, уравновешенную 0,002 М калийфосфатным буфером, рН 7,5, содержащим-з1 х 10 М ф-меркаптоэтэнол и 5 х 10 М ЭД ТА (буфер А). Колонку промывают буферомА и элюируют фермент 300 мл градиентаМэС 0,0-0,1 М в буфере А, Фракции, содержащие рестриктазную активность, элюируемые при 0,6 - 0,7 М йэС, объединяют и диализуют против 2 л буфера А. Фермент после диализа наносят на колонку с гепарин-сефарозой объемом 5 мл, уравновешенную буфером А, и промывают колонку тем же буфером. Элюцию фермента прводят 100 мл градиента йаС 0,0 - 1 М в буфере А. Фракции, содержащие рестриктазу, элюируемые при 0,32 - 0,37 М КаС, объединяют и диалиэуют против буфера А, содержащего За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Л в течение 1 ч при 50 С,Ферментный препарат хранится при -20 С, Выход фермента 100 ед./г биомассы, активность 100 ед./мл.Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Еап .Для определения последовательности узнавания рестриктазы Еаппроводят сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК рВЯ 322 рестриктазой Еап , с величинами длин фрагментов, рассчитанных для рэзличных тетра-дента- и гексануклеотидных по.- следовательностей, Обнаружена только одна последовательность, для которой рассчитанные величины фрагментов хорошосовпадают с экспериментальными (см, таблицу). В таблице приведены величины длинфрагментов. установленные экспериментально и рассчитанные теоретически для последовательности 5 -ССС 6 С. Таким образом сайтом узнавания фермента Еап3 -666 С 6-5является последовательность 3 -666 С 6-5Для подтверждения установленной последовательности узнавания проводятсравнение величин длин фрагментов ДНКфага Л С 1857, полученных экспериментально и рассчитанных для последовательности5 -ССС 6 С 3 -666 С 6-5 ,Обнаруженный штамм является уникальным, т.к. продуцируемая в нем рестриктаза узнает и расщепляетпоследовательность нуклеотидов5 -ССС 6 С 3 -666 С 6-5 ,Это новый не известный ранее продуцент рестриктазы, не имеющий аналогов,Формула изобретения Штамм бактерий ЕачоЬастегоп ас оаэи е В КП М В- и роду цент рестри ктазы Еап ,1661213Составитель И. Привалова Редактор М, Стрельникова Техред М,Моргентал Корректор Т. Кол Заказ 2097 Тираж ( Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101