Способ получения фермента днк-цитозин-метилазы 1 из клеток

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспубликц 737443(61) Дополнительное к авт. свид-ву -Заявлено 27,10,77 (21) 2537615/28-13соелннением заявки,% 51)Ч. Кл. С 12 Э 13/1 Гасударственный квинте СССР по делам нэвбретеннй(088,8 а опубликования оп 2) Авторы изобретен ф, Нестеренко, Я. И, Бурьянов и А, А, Бае зиологии микроорганизм иохимии АН СС) Заявитель ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ДНК-БИТОЗИНМЕТИЛАЗЫ 1 ИЗ КЛЕТОК ЕЬСНШ 1 СИТК С,ОЫМЮ 600 чистоты ко% примесей, 190 раз выактивности),чить Изобретение относится к способам -получения ферментов из микроорганизмов,а именно к способам получения гомогенных ДНК-метилаз,Наиболее близким по технической сущности к заявленному является способ получения фермента ДНК-цитозин-метнлазы1 из клеток ЕбсЪегтсЬа СоО ЬЩ.600прецусматривающий дезинтеграцию биомассы, центрифугирование при 165000тоосаждение из полученного бесклеточногоэкстракта нуклеиновых кислот, фракционнрование белкового раствора сульфатомаммония, обессоливание фракций, содержащих фермент, для чего их собираютцентрифугированием, растворяют в минимальном объеме буфера, диализуют и хроматографируют на колонках с ДЕАЕ-сефадексом А -50 и фосфоцеллюлозой Я,К полученному раствору цобавляютрапе вныйобъемглицерина и хранят при теморатуре - 20 С.Описанный метоц не позволяет полуферментный препарат ДНК-метилазы с достаточной степенью нечный продукт содержит 8 Кроме того, при очистке в ход не более 8% (от обшей Белью изобретения является получение гомогенного препарата и увеличениявыхопа фермента, Бель достигается тем,что перед стабилизацией белковый раствор хроматографируют и рехроматографнруют на ДНК-агарозе, затем хроматографируют на КМ-целлюлозе и полученный раствор пропускают через последовательно соединенные колонки с ДЕАЕцеллюлозой и фосфоцеллюлозой рП, приэтом центрифугирование гомогената, осуществляют при 10000-3000 с, осаждение нуклеиновых кислот проводят протаминсульфатом, обессоливание фракцийведут гельфильтрацией на сефадексе 0-25а стабилизацию ферментного препаратаосуществляют диализом против раствораглицерина,Осаждение нуклеиновых кислот осу3 737443целлюлозой и фосфоцелдюлозой, ДНК-а- тозин-метилазу 1 элюируют в фосфоцеллюлозной колонке с буфером, Затем раст,вор аиализуют против глицерина,П р и м е р, 5 кг биомассы ЕэсЬе 1- СЫа СоЬ МКЕ 600 разрушают при тем.опературе +4 С на прессеМапоп боо 6 э%суэ,Разрушенные клетки суспенаируют в 15 л0,02 М трис-НСбуфера рН 7,4, сопер 10 жащего 5%-ныйглицерини 7 мм меркаптоэтанол (ТМ-буфер), Все последующиестадии проводят при температуре 0-4 С,Неразрушенные клетки и аебрис упадяютцентрифугированием при 10000 в течение 30 мин. Нааосааочную жидкость используют пля выаеления фермента,К 16 литрам бесклеточного экстракта в течение полутора часов при перемешивании добавляют порциями 5 литров2,0% протаминсульфата, Осадок удаляютцентрифугированием при 10000(у в течение 30 мин,К 19 лиарам напосааочной жидкостидобавляют сухой(йН) 0,1 ао 40% отполного насыщения, Осадок удаляют центрифугированием, К подученному супернатанту аобавляют сухой ( ЙН )ЯО по 60 Уот полного насыщения, Осадок собираютцентрифугированием и растворяют в1000 мл ТМ буфера. Раствор .педят нааве разных части и наносят на колонки(5 х 70 см) с сефапексом (-25, уравновешенном ТМ буфером, Объем обессоленного раствора поводят ао 4 л и добавляют сухой йаСВ по 0,15 М (НН фО-фШИ,ф 42 4 шествляют 0,5-0,6%-ным раствором прота м инсул ьфата.Х рома тогрдфию на Д НК-агар озе ве ду тв линейном градиенте хлористого натрияот 01 по 06 М,Рехроматографию на ДНК-агарозе вепчт в линейном градиенте хлористого натрия от 0,1 по 0,3 И.Хроматографию на КМ - целлюлозевеаут в линейном градиенте хлористогонатрия от 0 ао 0,1 М.Диализ ведут в течение суток против2-х кратного объема 60% раствора глицерина в ФЕМ-буфере,Сущность сйособа состоит в том, что15летки Е, СО 11 МКЕ 600, выращенныепо конца логарифмической стадии ростапезинтегрируют в буфере, Полученныйгомогенат центрифугируют при 1000030000 у После центрифугирования в бес 0клеточный экстракт добавляют протаминсульфат пля осаждения нуклеиновых кислот и сопутствующих метилаз, Полученный супернатант фракционируют сульфа 25том аммония, Осадок, растворенный вбуфере, обессоливают на колонках с сефадексом С, В обессоленный раст вор добавляют хлористый натрий и фоакционируют на колонке с ДЕАЕ-сефааексом30Фракцию с ДНК- метилазной активностьюконцентрируют высаливанием сульфатомаммония. Осааок растворяют в буфере ипомещают на колонку с ДНК - агарозой. Фракции с ДНК - цитозин - метила 35зой 1 объеаиняют, концентрируют ультрафильтрацией, разводят буфером, рехроматографируют на ДНК - агарозе,В отличие от"остап" Р -11 фосфоцеллюлозы, которая применялась ранее40на этом этапе, ДНК-агароза является более мягким ионообменником и облаааетвысокой удельной емкостью с повышенным сродством к ферменту, Процесс приготовления ДНК-агарозы нетрупоемкий,При хроматографии фермента на ДНК-агарозе результаты хорошо воспроизводимы,фермент меньше инактивируется, Такимобразом, применение ДНК-агарозы наэтом этапе позволяет получить фермент50с высокой степенью очистки н большимвыходом, Выхоа фермента на этой стадии составляет 57%.Собранную активную фракцию палеекрнцентрируют на" %Ф 1 аЬтап" Рфосфоцеллюлозе, хроматографируют на КМцеллюлозе, Фракции, обладающие активностью, объединяют и наносят на послеповательно соепиненные колонки с ДЕАЕЭту фракцию наносят йа колонку (10 х 100 см) с ДЕАЕ-сефааексом Асо скоростью 400 мл/ч, После того, когда выйдет раствор свободного объема колонки (около 3 литров), собирают еще 1,5 литра опалесцирующего раствора и отбрасывают, ДНК-метилазную активность собирают в следующих 5 литрах элюирующего раствора.Элюат концентрируют высаливанием белков сульфатом аммония ао 70% от полного насыщения, Осадок собирают центрифугированием, растворяют в 600 мл ФЕМ-буфера (20 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,0, 1 мМ ЭДТА; 7 мМ 2-мер- каптоэтанол; 5% глицерин), анализируют против 5 литров ФЕМ-буфера с четырехкратной сменой в течение суток (фрак-. ция 2).Хроматография на ДНК-агарозе, Раст вор белка после анализа наносят на колонку (5 х 30 см ) с ДНК-агарозой, уравмымют ФГМ-буфером, содержащим 0,05 М ИаС 1 и колонки разъединяют, ДНК-метилазу 1 алюируют с фосфоцеллюлозы ФЕМ-буфером, содержащим 0,35 м МаС 1 со скоростью 30 мл/ч в объеме 60 мл дополнительно конценч- рируют диализом против двух объемов 70 О/о глицерина в ФЕМ-буфере в течение суток, фермент хранят при -20 С,Применение предлагаемого метода по воляет получить гомогенный фермент и повысить выход в 3,5 раза по сравне-, нию с ранее предложенным способом,формула изобретения 1, Способ получения фермента ДНКцитозин-метилазы 1 из клеток Е 5 сЬеч -АСМО СОЛОМКЕ 600, предусматривающийдезинтеграцию биомассы, центрифугирование гомогената, осаждение из полученного бесклеточного экстракта нуклеиновых кислот, фракциониромние белкового раствора сульфатом аммови, обессоливание фракций, содержащих ферментс последующей хроматографией на ДЕАЕсефадексе и стабилизацией готового продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью получения гомогенного препарата и увеличения выхода фермента,перед стабилизацией белковый растворхроматографируют и рехроматографируютна ДНК-агарозе, затем хроматографируютна КМ-целлюлозе и полученный растворпропускают через последовательно соединенные колонки с Д ЕА Е-целлюлозой и фосфоцеллюлозой р Й приатом центрифугиромние гомогената осу-1 цествляют при 10000-30000 осаждение нуклеиновых кислот проводят протаминсульфатом, обессолимние фракциейведут гельфильтрацией на сефадексеЯ а стабилизацию ферментного препаратаосуществляют диализом против раствораглицерина,2, Способ по и, 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что осаждение нуклеиновых кислот осуществляется 0,5-0,6%-ным раствором протаминсульфата,3. Способ по и, 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что хроматографию на ДНК-агарозе ведут в линейном градиенте хлористого натрия от 0,1 до 0,6 М,4, Способ по и, 1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что рехроматографию на ДНК-агарозе ведут в линейном гра 5 7374повешенной ФЕМ-буфером со скростью60 мл/ч и промывают ФЕМ-буфером, содержащим 0,1 М 1 ЧОСС до тех пор, покаоптическая плотность элюата не упадетдо нуля, Хроматографию ведут 6 л ФЕМбуфера с линейно повышающейся,конценчрацией АВОСЮ от 0,1 до 0,6 М со скоростью 60 мл/ч, фракции собирают по 20 мл.фермент, элюируют со средней концентрацией НаС 60,25 М в объеме 600 мл, фрак ции с активностью ДНК-цитозин-метилазы1 объединяют и концентрируют ультрафильтрацией в системе Амикон через мембрануРМдо 80 мл и разводят буферомв 2,5 раза до 200 мл (фракция 3),200 мл фракции 3 наносят на колонку(5 х 5 см) с ДНК-агарозой, уравновешенной ФЕМ-буфером, содержащим 0,1 МНИСЬ,промывают 120 мл этого же буфера иведут хроматографию 3 л ФЕМ-буферас линейно повышающейся концентрациейКОСЬ от 0,1 до 0,36 М со скоростью60 мл/ч, фракции собирают по 15 мл,ДНК-питозин-метилазу 1 элюируют сосредней концентрацией ЙОС 6 0,22 М25в объеме 450 мл (фракция 4),фракцию 4 концентрируют на колонке(5 х 1 см) с "ФЪо,агап Рфосфоцеллюлозой; уравновешенной ФЕМ-буфером, Для этого фракцию делят на 4-5равных частей и каждую часть перед нанесением на колонку разводят в 2,2 раза фЕМ-буфером, нанесение со скоростью200 мл/час, ДНК-метилазу 1 алюируютс колонки ФЕМ-буфером, содержащим 0,35 М 5ЯаС 1 со скоростью 40 мл/ч, Весь белковый пик с ДНК-цитозин-метилазой 1 выходит в объеме 60 мл, Этот белок диализуют против 5 литров 0,01 М калий40фосфатного буфера рН 7,0 в течение 16 чс двукратной сменой, далее раствор белкананосят на колонку (2,6 х 10 см) с КМцеллюлозой, уравновешенную диализнымбуфером, со скоростью 20 мл/ч. Колонку45промывают 120 мл этого же буфера соскоростью 30 мл/ч, Хроматографию ведут750 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера с линейно повышающейся концентрациеййаС 1 от 0 до 0,1 М со скоростью30 мл/ч, фракции собирают по 15 мл,50Активностью ДНК-цитозин-метилазы 1обладают фракции со средней концентрацией МаС 1,равной 0,05 М в объеме250 мл (фракция 5).Фракцию 5 наносят на две последомтельно соединенные колонки (5 х 1 см)с ДЕАЕ-целлюлозой и фосфоцеллюлозойсо скоростью 120 мл/ч, Колонки про"диейте хлористого начия от 0,1 до0,3 М,,5, Способ по п, 1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что хроматографию наКМ-целлюлозе ведут в линейном градиенте хлористого натрия от 0 до 0,1 М,6, Способ по п, 1, о т л и ч а ю -ц и й с я тем, что диализ ведут в те 3 8чение суток против 2-х кратного объема60% раствора глицерина в ФЕМ-буфере.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Бурьянов Я, И, Нестеренко В. Ф.,Вагабова Л, М, Доклады Академии НаукСССР, т, 227, ,6, 1976, с, 19721975.Составитель В, НестеренкоРедактор Т, Морозова Техред Н. Бабурка Корректор И, МускаЗаказ 2602/7 Тираж 522 ПодписноеБНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретения и открытий113035, Москва, Ж, Раушская набд, 4/бфилиал ППП "Патент, г, Ужгород, ул, Проектная, 4