Штамм бактерий асinетовастеr саlсоасетiсus продуцент рестриктазы аса 1

/14,)5 С ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ИЗОБРЕТЕН ОПИС К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ ноеобьединение кий институт СО рев, Н.И,Речкунозина и Т.П.Виногез. 1985, ч.13,ЕТОВАСТЕК НТ Р 1;СТРИКо Всесоюзнои микроорганизИзобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и представляет собой штамм, и родуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -ССАИ 5 Т 66-3 .Рестриктаза данной специфичности. может быть использована для работ по клонированию, физическому картированию генов, а также является удобной моделью для изучения механизмов белокнуклеиновых взаимодействий,Целью изобретения является выявление штамма-продуцента, синтезирующего одну сайт-специфическую рестриктазу, способную узнавать и рас 1 Чеплять последовательность нуклеотидов 5 -ССАИ 5 ТСС.Новый штамм Ас 1 петоЬассег сасоасебсоз - продуцент рестриктазы Аса(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ АС СА СОАСЕТСОЯ - ПРОДУЦ ТАЗЫ АСА(57) Изобретение хранится коллекции промышленных мов ВНИИ генетика под коллекционным номером ВКПМ В, получен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаэ рестрикции в природных условиях. При культивировании штамма на питательной среде при 25 С в термостатированных качалках до достижения логарифмической фазы роста получают урожай клеток, из которых после дезинтеграции ультразвуком и хроматографических очисток получают фермент Аса 1, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -ССАМ 5 ТОС. Выход фермента 1060 ед,/г, активность 5000 ед./мл. Штамм используется для получения рестриктаэы, которую применяют в генетической инженерии для создания ф рекомбинантных молекул и для физического картирования молекул ДН К.выделен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов рестриктаз в пресной воде методом скрининга и хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института ВНИИ генетика, коллекционный номер ВКПМ В.Штамм А.са 1 соасебсиз ВКПМ Вхаратериэуется следующими признаками.Морфологические признаки.Клетки кокковидные. в основном расположены парами 0.5 - 0,8 мкм. грамотрицательные. На МПА образуют средние, блестящие, выпуклые колонии с ровными краями. На синтетической среде с ацетатом образуют мелкие беловатые колонии.Физиологические признаки.Хемоорганотроф. Аэроб, каталазоположительный, оксидазоотрицательный. Не да 1661212ет роста при замене ацетата глюкозойи/или маннитом, Нет роста на безазотистойсреде Эшби с глюкозой, маннитом и ацетатом, Глюкозу не окисляет и не сбражйвает.Сероводород не образует.Индолотрицательный, Устойчив к ампициллину, хлорамфениколу, чувствителен к тетрациклину,канамицину, стрептомицину. Доля 6 С вДН К% (по плавучей плотности).Культуральные признаки. 10Дает рост на МПА, при температурномдиапазоне от 5 до 30 С. Оптимальнаятемпература 25 С. Оптимальный рН 7. Растет при 0,5 - 30 йаС. Оптимальная для роста О,б 1 чаС 1. Требователен к аэрации. 15Хранение осуществляют под вазелиновыммаслом в 30%-ном глицерине при 70 С.П р и м е р 1. Получение биомассы ивыделение рестриктазы,Ночную культуру штамма 20А.са 1 соасебсоз засевают в свежую питательную среду, состоящую из 10 г/л триптона ("ОИсо"); 5 г/л дрожжевого экстракта1,"Зегча"); 6 г/л йаС 1; остальное вода. Культивируют при 25 С в термостатированной 25качалке в двухлитровых колбах с 200 млпитательной среды при 200 об/мин до достижения логарифмической фазы роста,Клетки осаждают центрифугированием при4 С. 10 г клеток суспендируют в ЗО мл 0,02 30М трис-НС 1 буфере, рН 7,5, содержащем1 х 10 М Р-меркаптоэтанол и О,трионХ, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе, Обломки клеток удаляют центрифугированием (1200 хц, 30 мин), 35надосадочную жидкость наносят на колонкус биогелем А 0,5 а (Во-Баб), объемом 500мл, уравновешенную 0,02 М калийфосфатным буфером, рН 7,5, содержащим 1 х 10 Мф-меркаптоэтанол; 5 х 10 ЭДТА; 0,8 М МаС 1; 400,1% тритон Х,00, (буфер А). Ферментэлюируют тем же буфером со скоростью 20мл/ч, Фракции объемом 10 мл собирают ианализируют на присутствие активного фермента, Фракции, содержащие рестриктазную активность, объединяют и диализуютпротив 2 л 0,02 М калийфосфатного буфера,рН 7,5, содержащего.1 х 10 МР-меркаптоэтанол и 5 х 10 М ЭДТА (буфер В). меняябуфер дважды. Диализат наносят на колонку объемом 30 мл с ДЕАЕ-целлюлозой (ОЕ 52, ЮЬа 1 вэп), урановешенную буфером В. Колонку промывают буфером В и адсорбированный фермент элюируют 300 мл градиента ИаС (0-1 М) в буфере В. Фракции, элюируемые при 0;2-0,3 М МаС 1, содержащие рестриктаэу, обьединяют и диализуют против 2 л буфера В. Фермент после диализа наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (Р, ОВаюап) объемом 10 мл, уравновешенную буфером В, и промывают колонку тем же буфером, Элюцию фермента проводят 200 мл градиента йаС 0,0 - 1 М в буфере В, Фракции, содержащие рестриктазу, элюируемые при 0,53 - О,б М йаС 1, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего 0,1 М ИаС 1 и 50 -ный глицерин.,П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента,Специфичность фермента определяют по картине совместного и параллельного гидролиза субстратной ДНК, Идентичность картин гидролиза указывает, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5 -ССАЙ 5 Т 66-3 .Выход фермента Аса 1 определяют по электрофоретической картине гидролизэ ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага в течение 1 ч при 37 С. Выход фермента составляет 1000 ед,/г, активность 5000 ед./мл.Предложенный штамм-продуцент является уникальным. Впервые в роде АспетоЬастег найден продуцент рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -ССФИ 5 Т 66-3Культивирование предлагаемого штамма является простой и воспроизводимой процедурой, не требующей дорогостоящего оборудования, Полученный штамм позволяет получать рестриктазу с выходом не менее 1000 ед,/г сырой биомассы, пополнив ассортимент рестриктаз, выпускаемых отечественной промышленностью.Формула изобретенияШтамм бактерий Ас 1 петоЬастег са 1 соасетсиз ВКПМ В- продуцент рестриктазы Аса 1,