Штамм бактерий sеrrатiа маrсеsсеns продуцент эндонуклеазы

(51)5 ИСАНИЕ ИЗС)БРЕТЕНИ а мутанта, полученноадии нитрозогуанидииболее активного ия - получение беспиг- Я,(пагсезсепз, обладаю- высоким уровнем тивности в культуральЦель изобретементного штаммащего болееэндонуклеазной аной жидкости,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Казанский государственный университет им. В,И.Ульянова - Ленина и Вышневолоцкий завод ферментных препаратов(56) Авторское свидетельство СССРИт 302367, кл, С 12 й 1/20, 1971,Авторское свидетельство СССР(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ЯЕВЯАТАМАЯСЕЯСЕИЯ - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм бакИзобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм бактерий Я, гпэгсезсепз, и родуци рующий неспецифическую эндонуклеаэу (К.Ф,З.1.4,9), которая может быть использована в научно-исследовательских работах по изучению противоопухолевых и противовирусных свойств эндонуклеазы при исследовании структуры хроматина для получения мононуклеотидов. терий Я.тагсезсепз, продуцирующий не- специфическую эндонуклеазу (К.Ф,З, 1.4.9), которая может быть использована в научноисследовательских работах по изучению противоопухолевых и противовирусных свойств эндонуклеэзы при исследовании структуры хроматинэ для получения мононуклеотидов. Цель изобретения - получение беспигментного штамма Яеггэ 1 э вагсезсепз ВКПМ В(28-13), обладающего более высоким уровнем эндонуклеазной активности в культурэльной жидкости, Полученный методом индуцированного мутагенеза беспигментный штамм Ялпагсезсепз 28-13 обладает эндонуклеэзной активностью активностью, в 150 раз превышающей активность исходног штамма ВйАТСС, в 1,5 раза - активность пигментного штамма ВКПМ Вс повышенной активностью эндонуклеазы, 1 табл. Штамм получен методом двухэтапной обработки;1 этап - облучение пигментного штамма З.п)агсезсепз 211 Вй АТСС - 9986 ультрафиолетовым светом с последующим отбором колоний с наибольшей эндонуклеазной активностью;Н этап - обработкго на предыдущей стном и отбор наи родуце нта.Штамм Я.гпэгсезсепз В КПМ В(28- 13) имеет следующие характеристики.Культурально-морфологические признаки. Клетки палочковидные размером 1,5-2 х 0,8 - 1 мкм, одиночные, парные или со 166121410 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 единенные в короткие цепочки, грамотрицательные, подвижные.На мясопептонном агаре через 24 ч роста образует блестящие гладкие бесцветные колонии, выпуклые, с ровным краем, 5диаметром 1,5 - 2 мм. На картофеле - блестящий бесцветный налет, Молоко свертывает,но не пептонизирует, желатин разжижаетмедленно.Физиолого-.биохимические и риз на ки.Ферментирует с образованием кислотыглюкозу, сахарозу, мальтозу, сорбит, инозит, маннит, салицилат, Не ферментируетлактозу, адонит, дульцит, ксилозу, арабинозу, рамнозу. Не расщепляет мочевину, сероводород, индол не образует. РеакцияФогес-Проскауэра положительная, реакцияс метил-рот отрицательная.Сптимальная температура для роста28 - 30 С, рН среды 7,4 - 7 б.Эндонуклеазная активность.Эндонуклеазная активность через 24выращивания на качалке 180 - 200 об.минпри оптимальной температуре достигает450000 - 500000 виск. ед./мл, 90000 - 100000опт. ед,/мл/ч, 150 - 160 мкм расщепленнойДН К/мл/мин.Ма;симальная эндонуклеазная активность наблюдается на 24 ч культивирования.Эндонуклеазную активность определяют вискозиметрическим методом и по продуктам гидролиза высокополимерной ДНК,растворимым в 2%-ной НСО. Реакционнаясмесь объемом 1 мл содержит: 1 мг ДНК,0,07 М трис-НС, рН 8,5, 0,007 М М 9 С 2. 0,1мл культуральной жидкости. Реакционнуюсмесь инкубируют 15 - 20 мин при 37 С,реакцию останавливают добавлением равного объема 40-ной охлажденной НС 04.Кислотонерастворимый материал удаляютцентрифугированием на холоду при 6000 д,20 мин, В надосадочной жидкости послеразведения в 20 раз измеряют оптическоепоглощение при 260 нм на спектрофотометре СФ. За единицу активности принимают количество фермента, которое даетувеличение оптической плотности в опытных образцах по сравнению с контрольными (реакционная смесь без Фермента), наодну оптическую единицу за час инкубациив пересчете на 1 мл культуральной жидкости(А 26 о ед/мл/ч).В качестве субстрата используют препараты высокополимерной ДНК из тимуса 5теленка, выделенной по методу Кэя в модификации Бенинга, или коммерческие препараты высокополимерной ДНК,Сравнительная характеристика активности внеклеточной эндонуклеазы штаммов Я,щагсезсепз известных и предлагаемого в качестве продуцента эндонуклеазы на питательной среде следующего состава:Глицерин 5Цитрэт аммония 5Двузамещенный фосфаткалия 10Сернокислый магний 0,5Хлористый натрий 0,5Сернокислое железо 0,025Гидролизат казеина 1Дрожжевой экстракт 3рН среды 7,6для получения эндонуклеазы представленав таблице.П р и м е р 1, Получение штамма с повышенной эндонуклеэзной активностью.этап, Исходный штамм ВйАТСС выращивают на мясопептонном агаре в течение 18 ч при 30 С. Выросшие клетки смывают 0,5/0-ным физиологическим раствором, осаждают центрифугировэнием и ресуспендируют в 0,1 М Ка-фосфатном буфере до оптической плотности 0,12 - 0,15 при 650 нм, Полученную суспензию клеток облучают бактерицидной ультрафиолетовой лампой БУФв течение 100 с, К облученной суспензии добавляют мясопептанный бульон - 1/3 объема суспензии и инкубируют в темноте в течение 3 ч при 30 С, После инкубирования клетки высеивают в чашки Петри с мясопептонным агаром, в который добавлен индикатор для выявления продуцентов эндонуклеазы, содержащий О,б мг/мл дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК) и 0,010/, толуидинового голубого, окрашивающего среду с ДНК с голубой цвет. Вокруг колоний, выделяющих эндонуклеазу, через 24 ч роста в результате гидролизэ ДНК образуется ореол розового цвета. Отбирают колонии с наибольшими по сравнению с контролем зонами ДНК-азной активности.этап. Клетки наиболее активного мутанта, отобранного наэтапе выращивают на мясопептонном бульоне до середины экспоненциальной фазы (ОП 65 о = 0,50) осаждают центрифугированием, отмывают отсреды 0,1 М фосфатным буфером, рН 5,5.Клетки суспендируют в том же буфере доОП 65 о = 0,40. К полученной рспензии добавляют И - метил - нитро й - нитрозогуанидин (Н Г ) мг/мл в 0,1 М цитратном буфере, рН 5,5) до конечной концентрации 75 мкг/мл.Клетки инкубируют в течение 30 мин в водяной бане при 37 С. Затем клетки осаждают центрифугированием, промывают 0,1 М фосфатным буфером, рН 7, чтобы удалить НГ,.и рассеивают разведением на чашки с индикаторной средой с ДН К, Отбирают бес1661214 Эндонуклеазная активность различных штаммов Я, гпагсезсепз Штамм Активность эндон клеазц в к льт альной жи кости опт, ед, /мл/ч виск, ед/мл мкМ расщепленной Н К/млl мин 41 ( пигментный ) Ви - 211 АТСС - 99861000 160 0,5 3000-3500 50000-60000 80000-90000 620-7003500-395013000-15000 1 - 1,514 - 16,5 21 - 25 300000-350000 60000-70000 100-116 450000-500000 90000-100000 150 - 160 Составитель И. ЧаплинаРедактор М, Стрельникова Техред М.Моргентал Корректор Т, Палий Заказ 2097 Тираж Г, Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 пигментные колонии с наибольшими зонами гидролиза ДНК. Все отобранные мутанты проверяют на эндонуклеазную активность на жидкой среде.Наибольшая активность выявлена у мутанта 28 - 13.П р и м е р 2. Изучение эндонуклеазной активности.Исходный штамм Вй - 211 АТССи штамм 28 - 13 выращивают в течение суток в пробирке со скошенной средой указанного состава, смывают 0,5 -ным физиологическим раствором и засевают из расчета 1 мл инокулята на 100 мл среды в колбу объемом 1 л с 200 мл среды.Выращивание ведут на качалке (200 об/мин) при оптимальной температуре 30 С в течение 24 ч. Затем бактериальные клетки отделяют центрифугированием при 60009, 20 мин. В надосадочной жидкости определяют эндонуклеазную активность вискозиметрически,и по продуктам гидролиза высокополимерной ДНК, растворимым в 2-ной НС 104. Результаты представлены в таблице,Полученный штамм отличается от исходного ВйАТССбольшими размерами клеток, более медленным разжижением желатина, от штамма ВКПМ 5 В- отсутствием пигментообразования.Эндонуклеазная активность штамма28 - 13 в 150 раэ превышает активность исходного штамма и в 1,5 раза штамма 10 ВКПМ - В. Наиболее высокая активность штамма 28-13 достигается на 24-й час роста.Использование предлагаемого штамма 28 - 13 в качестве продуцента эндонукле азы позволяет повысить эндонуклеазнуюактивность за период одной ферментации на 150;ь по сравнению с культивированием на той же среде штамма ВКПМ В. Преимуществом предлагаемого штамма по 20 сравнению со штаммом ВКПМ Вявляется стойкое отсутствие пигментации. Формула изобретения Штамм бактерий Яеггат 1 а аагсезсепз25 ВКПМ В- продуцент эндонуклеазы.