Способ биотинирования нуклеиновых кислот

Номер патента: 1443404

Авторы: Вейко, Карпухин, Салимов, Спитковский

ZIP архив

Текст

(51) 5СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ Б 150 ОБРЕТЕН ЬСТВУ НУКЛЕИН ИСАНИЕ ИЗ И АВТОРСКОМУ СВ(7 1) Институт медицинской генетикиАИН СССР(54) СПОСОБ БИОТИНИРОВАНИЯ ОВЬБ КИСЛОТ(57) Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике и можетбыть использовано в других областяхбиологии и .в медицине для нерадиоактивного мечения нуклеиновых кислот.Целью изобретения является увеличение чувствительности индикации мечен.ных биотином ДНК при дот-гибридизации. Биотин присоединяют к нуклеиновой кислоте в две стадии. При этомна первой стадии присоединяют соединение, содержащее фотоактивируемуюгруппу и полимерную цепочку с положительно заряженной аииогруппой на конце, а именно й-(4-азндо-нитробенэоил)-1,7 днаииногептан, а на второй - бифункциональный реагент, содержащий бнотин и взаимодействующий с аминогруппой, а именно К-оксисукцинимидный эФир биотинил-Е-аминокапроновой кислоты, Для реализации способа синтезирован фотоактивируемый реагент К-(4-азндо-нитробенэоил)-1,7-днаминогептан. Наличие положительного заряда на первой стадии и его блокирование на второй обеспечивает высокий уровень ковалентного присоединения биотина к ДНК и снижение неспецифической сорбции, Способ и синтезированный для его реализации реагент позволяют также увеличить расстояние между фотоактивируемой группой и биотином, что повышает чувствительность. Применение биотинированной предлагаемым способом ДНК для гибридизации позволяет выявлять до 10 г гомологич(4ной ДНК, причем негомологнчная ДНК7в количестве 10 г не выявляется.Изобре 1 ене 1 е Относитснк молеку АЙПЕЕОЙ биолОГии и.генетике и мол(ет быть использовано в других областях Оиопогие 1 и и медещине для нерадно-актпвного г 1 ечення нуклеиновых кислот.5Целью изобретения является уве" личение 1 еувствительности индикации меченных биотином ДНК при дот.-гибри" , де 1 за 1 вш.10Б способе, включающем добавление к раствору нуклеиновой кислоты фотоакте 1 вируеиого реагента с последующим облучением раствора светом, в качестве фотоактивируемого реагента исполь" 15 зу 1 от бифункциональное соединение,содержащее фотоактивируемую группу и гЕоложительно заряженную первичную а(ИЕногруппу, соединен 11 ые на несущей заряда полимерной цепочкой, и после облучения светом обрабгтьпзают полученное соединение бнФу 11 кцнонал 1 цьи .реагентом, содержащим активнрованньп 1 сложнь 111 эфир и биотин, которые соединены полимерной. цепочкой. 25фотоакте 1 вируемьей реагент для реализациии способа - 11- (4-аэ 11 до.- 2-пнтробензоил)-1,7-де 1 амкногеггггн Фор 11 УЛЫ303.А 7ИОП р и м е р 1. По.:уче 1 п 1 е Фоеоактивиррсщего реагентг, 70 ммоль 2-нитро-гминобензойноп кислоты суспендируют в 120 мл воцы и по каплям прибавляют 4 ОЖ-ны 11 раствор едкого калил до полного растворенил кислоты. В получе 1 гный .раствор вносят 60 ммоль нитрита натрия и охлаждаютодо 0 С. Этот раствор по каплям при энергетичном перемешивании добавляюток охлажденной до -2 С сь 1 еси,.ЗОмл концентрированной соляиой кислоты и 150 мл воды. Смесь оставляот на30 мин при 0 С и затем 11 ри перемешивании добавля 1 от 60 ммоль азида натрия растворенного в 40 мл во 11 ы, Далее все операции с гэидами проводят в затемненной комнате, Лосле 30 минреакции прн комнатной температуре осадок отделяют, Перекристаллиэонываеот из воды. Выход очищенной 4-аэидо-нитробензойной кислоты состав 55 ляет 65 Ж. 20 ммоль 4-аэ 11 до-нитробензойной кислоты растворл 1 от в 25 мл диоксана, прибавляют по 20 ммоль Б-оксисукцинимида и дициклогексилкарбодиимида, Реакционную смесь выдер" . жнааЕот.20 ч при 20 С и сильном встря" хивании. Выпавший осадок отфильтро" вывают и промывают диоксаном. фильтрат уаривают при пониженном давлеииие Полученный Б ОксиДукцинимидный эфир 4-аэидо"нитробензойной кислоты используют в дальнейшем беэ предварительной очистки.К 2 ммоль 1,7-диаминогептана в 3 мл диокеана добавляют по каплям раствор 1 ммоль Б"-оксисукцинимидного эфира 4-азидо-нитробензойной кислоты в 3 мл диоксана, смесь выдерживают при 20 С и сильном перемешнованинВыпавший осадок отделяеот центрифугированием, промывают дваждье дпоксаном и,все Фракции супернгтгнта объединяют. Диоксновый р":твор разбавляют в 5 раз .1 одкисле н 110 Йводой у появлшощийся 1 ебольк.% осадок убирают центр 4 уг 11 ров 1 ие.(. Дополнительную очистку проводят с помощело тонкослойной хроматографии в системе хлороформ - этанол (8:2)Продукт двигается одной Уф-гоглощающей .зоной4и не содержит примесей 4-азкдо- -йитробенэойной 1(ислот.,1 нли ее эфира,11 алпчие гэидпой группы подтверждается появленисм в 11 К-спектре характерной азидной полосы 2140 см с нео(.льшеЕм плечом при 2120 см.Спектр гэглсщеннл: " , 260, 370 нм. При облучении светом раствора наблюдается свойственное гэидам падение поглощения в Уф-част 11 спектра, Наличие первичной аминогруппы подтверждено нипгидриновой реакцией и реакцией с 11-оксеЕсукциннмидньем эфиром биотинилв(.-аминокапроновой кислоты, в результате которой получается один Уф-поглошаощий продукт, по подвижности отличный от исходного. П р и и е р 2. Реализация способа.Реакцию фотолиза Фотоактнвируемого реагента проводят в О, 1 м 11 ЗДТА в присутствен 1 Д 11 К в стеклянном ка илляре. Облучают вЕщтщым светом с длиной волны 340-380 нм. Посче экстракцни избытка реа 1.ента втор-бутанолом добавляют 10-кратный избыток (по отношен 1 во к основг 11 цям ДНК) 11-,оксисукцинииндного эФнрг биотинеел-(.-амиЕнокгпроновой кислоты, Смесь выдерживают 1 ч при 20 С, дважды экстрагируютСоставитель А. СпунизРедактор Л.Волкова Техред М.дидык Корректор Э.Лончакова Заказ 3329 Тираж 494 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 415Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 втор-бутанолом и ДНК осаждают 703 пым этанолом.Биотинированную ДНК иммобилизуютна нитроцеллюлозных фильтрах нагреванием при 80 фС в течение 2 ч. Дотгибридизацию проводят, при 39 С всреде, содержащей 507. формамида и0,4-0,75 М йаС 1 в течение 3-15 ч,После обработки авидином и биотини"рованной щелочной фосфатаэой определяемые количества ЦНК сбставляютзначения порядка 10 -10 г,При применении данного способаи синтезированного для его реализации вещества достигнута чувствительность, примерно на два порядкаболее высокая по сравнению с прототипом. Положительный эффект связанс увеличением расстояния между фотоактивной группой и биотином,Способ биотинирования нуклеиновых кислотвключающий добавление краотвору нуклеиновой кислоты фот 9"актияируемого реагента с последуюзряоблучением раствора светом, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с далью 10 повышения чувствительности индикацнИмеченных биотином ДНК при дот;.гибридизации, в качестве фотоактивнруемо- .го реагента используют 0-(4-аэидо""2-нитробенэонл)"1,7-днаминогептан 15 с последующей обработкой полученногопосле облучения светом соединения.О-окснсукцинимидным эфиром биотиний"Е-аминокапроновой кислоты в количестве достаточной для блокирования 20 всех аминогрупп.

Смотреть

Заявка

4220383, 13.09.1987

ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ГЕНЕТИКИ АМН СССР

КАРПУХИН А. В, ВЕЙКО Н. Н, САЛИМОВ А. Г, СПИТКОВСКИЙ Д. М

МПК / Метки

МПК: C12N 15/00

Метки: биотинирования, кислот, нуклеиновых

Опубликовано: 23.09.1990

Код ссылки

<a href="https://patents.su/3-1443404-sposob-biotinirovaniya-nukleinovykh-kislot.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ биотинирования нуклеиновых кислот</a>

Похожие патенты