Способ получения ферментного препарата, содержащего липазу

(23) Приоритет - (3 (31) Р 2408379.2 (33) 21,02.74РГ Государственный кощит Совета Министров ССС по делам изобретений Опубликовано 05,02.77. Бюллетень5 Дата опубликования описания 02,03.77(088.8) ткрытии 2) Авторы изобретения Иностранцы Ганс Бетцинг(71) Заявител Иностранная фирма А, Наттерманн и КИ ГмбХ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕ 11 АРАТА,СОДЕРЖАЩЕГО ЛИПАЗУИзобретение именно к получ Известен сп препарата, соде щийся в том, ч ную железу по среде при 20 -ривают в бутан ракт, осаждаю ворителем, напганиче шивая, створ и провед 24 ч,п 0 - 4 С относиениюособржащто раздверга30 С воле, пт ферример 1тся к микробиологии, а ферментных препаратов. получения ферментн ого его липазу, заключаюмельченную поджелудочют автолизу в щелочной течение 30 мин, обезжиолучают водный экстмент органическим растэтанолом, и гысушивают Однако известный способ обеспечивает невысокий выход ферментного препарата с низкой активностью липазы.С целью повышения выхода и активности 15 липазы по предлагаемому способу проводят дополнительное обезжиривание ткани перед автолизом в смеси хлороформ-бутанол и автолиз проводят в течение 24 - 96 ч, преимущественно 48 ч, при 0 - 4 С. Кроме того, допол О нительное обезжиривание проводят в смеси, содержащей 9 об. ч. хлороформа и 1 ч. бутанола.Способ осуществляют следующим образом.Глубокоохлажденную ткань поджелудочной 25 железы после оттаивания сначала со смесью (9;1) хлороформа и бутанола размельчают в мясорубке или в миксере, после удаления орского растворителя ткань, снова разме обрабатывают такой же смесью ра телей, затем еще влажный остаток для ения автолиза оставляют в течени редпочтительно 48 ч, в леднике при После автолиза тканевыи материал, в большей степени обезжиренный, перемешивают дважды с ацетоном и затем каждый раз отделяют растворитель. Для отделения богатого липазой ферментного материала сухой порошок ткани повторно размешивают со смесью вода-этанол (95: 5), отделенные от ткани растворители соединяют и посредством добавления ацетона и последующего центрифугирования образовавшейся суспензии осадок отделяют, который затем обрабатывают ацетоном и высушивают в вакууме, Полученный препарат представляет собой тонкий серо-белый порошок с высокой активностью липазы.Так как в полученных водно-спиртовых экстрактах энзим находится с высокой степенью чистоты, эти 5%-ные спиртовые экстракты могут быть непосредственно применены для получения препаратов липазы так, что соединенные экстракты подвергают высушиванию вымораживанием, При этом богатый546283 Формула изобретения 45 50 55 00 Ц 1-1 ИИПИ Заказ 233,14 Изгь Мо 400 Тираж 589 Поли понос ир. Сапунова, 2 Типография 3липазой ферментный препарат выпадает в виде сухого серо-белого порошка.П р и м е р 1. 5,0 кг глубокоохлажденной свиной поджелудочной железы после оттаивания освобождают от содержащегося жира, грубо размельчают и гомогенизируют в 5 л смеси хлороформ-бутанол (9; 1) в смешивающем аппарате или в мясорубке. Образовавшуюся тканевую кашу размешивают в течение 30 мин при комнатной температуре, жидкую фазу, содержащую хлороформ, декантируют и затем остаток размешивают еще два раза, каждый раз с 5 л хлороформ-бутанол (9:1) в течение 30 мин при комнатной температуре и каждый раз декантируют раствори- тель. Влажный остаток оставляют на 48 ч при 0 - 4 С. Затем обезжиренный орган размешивают еще два раза, каждый раз с 2,5 л ацетона в течение 15 мин и каждый раз декантируют отстаивающийся наверху растворитель. Для экстракции богатого липазой фермента полностью обезжиренный материал размешивают два раза, каждый раз с 2 л смеси вода-этанол (95; 5) в течение 30 мин и затем отфильтровывают раствор.Отдельные экстракты вода-этанол соединяют и для осаждения фермента поджелудочной железы размешивают с 5 л ацетона в течение 15 мин при комнатной температуре, После центрифугирования осадок промывают еще 3 раза, каждый раз с 1,6 л ацетона, затем высушивают в вакууме и размельчают,Выход: 450 г (9% в отношении к мокрому органу) желтоватого порошка с активностью липазы 270 ЕД/г.П р и м е р 2, 2 кг сухозамороженной свиной поджелудочной железы экстрагируют три раза, размешивая в течение 30 мин, каждый раз с 5 л хлороформ-бутанола (9:1) и каждый раз декантируют растворитель, Влаждый остаток оставляют стоять в течение 60 ч при 0 - 4 С. Для завершения обезжиривания размешивают еще два раза, каждый раз в течение 15 мин с 2,5 л ацетона и каждый раз отфильтровывают растворитель.Для экстракции ферментов поджелудочной железы обезжиренный остаток органа обрабатывают дважды, каждый раз с 2 л смеси вода-этанол (95:5) в течение 30 мин, причем каждый раз отфильтровывают раствор от остатка. Соединенные экстракты вода-этанол размешивают с 5 л ацетона в течение 15 мин при комнатной температуре и отцентрифугируют выпавшие богатые липазой ферменты. Осадок промывают еще три раза, каждый раз 1,6 л ацетона, высушивают в вакууме и размельчают.П р и м е р 3, 3 кг глуоокозамороженной свиной поджелудочной железы мелко размельчают в мясорубке и гомогенизируют с 3,0 л смеси из хлороформа и бутанола в объемном соотношении 9:1 в мешалке. Получен 5 10 15 20 3 З 35 40 4ную органную кашу размешивают в течение 30 мин при комнатной температуре, содержащую хлороформ, жидкую фазу отводят и остаток размешивают еще дважды, каждый раз с 3,0 л хлороформ-бутанола в объемном соотношении 9:1 в течение 30 мин при комнатной температуре и каждый раз отделяют растворитель. Еще влажный остаток оставляют стоять в течение 48 ч при 4 С. Затем в большей степени обезжиренный орган размешивают еще 2 раза, каждый раз с 1,5 л ацетона в течение 15 мин и каждый раз декантируют отстоявшийся наверху растворитель.Для экстракции богатого липазой фермента поджелудочной железы полностью обезжиренный материал размешивают два раза, каждый раз с 1,5 л смеси вода-этанол в объемном соотношении 95:5 в течение 30 мин и затем отфильтровь 1 вают раствор через металлическое сито. Соединенные экстракты вода-этанол с целью удаления растворителя помещают в сушильный аппарат для вымораживания (толщина слоя около 1 - 2 см, начальная температура 20 С, конечное давление 10 - ф" торр, конечная температура 20 С). Сухой пористый материал размельчают и просеивают, Выход: 365 г (12% в отношении к мокрому органу) светло-желтого порошка с активностью липазы около 250 ЕВ/г.Активность липазы ферментного препарата, получаемого по предлагаемому способу, определяют по методу Виллштеттера и ЛацоВазема. Активность липазы по Виллштеттеру равна 240 Е/г, а активность липазы по ЛацоВазему 8000 Е/г, что значительно выше активности известных в продаже ферментных препаратов, активность липазы которых от 40 до 60 ед. по Виллштеттеру ЕВ/г, а активность липазы по Лацо-Вазему (в единицах Вильсона) равна 2450 Е/г. 1. Способ получения ферментного препарата, содержащего липазу, путем размельчения поджелудочной железы, автолиза, обезжиривания ткани, получения экстракта, осаждения фермента органическим растворителем и высушиванпя, отл ич а ю щи йся тем, что, с целью повышения выхода и активности липазы, проводят дополнительное обезжирпвание ткани перед автолизом в смеси хлороформ-бутанол и автолиз проводят в течение 24 - 96 ч, преимущественно 48 ч, при 0 - 4 С.2. Способ по п. 1, о т л и ч а 1 о щ и й с я тем, что дополнительное обезжиривание проводят в смеси, содержащей 9 об. ч. хлороформа и 1 ч. бутанола.Источник информации, принятый во внимание при экспертизе заявки:1. Великобритания, п. М 1328202, кл. С ЗН, 1973.