Способ выделения рибонуклеиновой кислоты из митохондрий

1. т -.лт О и и с Ж"нЙ е И 306 ВЕТЕНИЯ с 11 ь 53595 О Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 29,08.75 (21) 2168799 1) М, Кл.2 А 61 К 37/10 исоединением заявки М осударственныи комите авета Министров СССР(088.8) ло делам изобретен и открытии ия описания 28,01,77 Дата опубликорБледнов и Н. Г. Шупп(72) Авторыизобретен В. Адрианов, Ю, А Второй Московс государственный м им, Н.Иий ордена Ленинаедицинский институПирогова 1) Зая,вител(54) СПОСОБ ВЫДРИ БОНУКЛ ЕИ НОВОЙ ИЗ МИТОХОНД ЕНИЯИСЛОТЫ Изобретение относится к области биохимии и может найти применение лля аналитического изучения и лля препаративцого получения рибонуклеиновой кислоты (РНК).Известен способ выделения РНК цз митохондрий, заключающийся в гомогенизацпитканей, центрифугирозании, осаждении митохондрий цз налосалочной жидкости, позторцом центрифугировании для очистки от примесей и ресуспендировании в Лепроте:ьььзи Ор ующ их смесях 11.Целью изобретения является выделениенедеградирозанной РНК,Это достигается тем, что гомогенизациьотканей проводят в буферном растворе, содержащем 1 - 10 ммолей хлористого магния и ингибиторы рибонуклеаз, например смесь 0,01 -0,1 а/о,поливинилсульфата и 0,01 - 0,1 /а макалоида, очистку проводят в тех же растворах,дополнительную очистку проводят путем цецтрифугирования через 5 - 10 а/а-ный растворфиь(олла ьнли обработки 0,1 - 0,2%-ым лигитонином, выделение РНК проводят при О -2 С и для депротеиццзации используют смесьфенол-хлороформ (1: 1 по объему).П р и м е р 1. Печень крыс извлекают и гомогенизируют в 0,01 моля трис-НС 1 буфере,рН 7,4, содержащем 0,25 мо гя сахарозы,1 лсмоль хлористого магния и смесь 0,5 а/а поливинилсульфата и 0,5 оссо макалоиласинтети- З ческих ингибиторов рибонуклеаз, Гохгогецат дважды центрифугируют при 500 д в течение 10,тсия лля удаления примесей целых клеток и ядер.Из полученной налосалочной жидкости мц тохонлриц осаждают цецтрифугировацием пр.ь 7500 д з течение 1 О лссся. Осадок митохондрий ресуспендируют в среде выделения и повторно переосажлают центрифугцрозанцем в тех же условиях. Эту процедуру очистки повторяют еще дважды. Выделенные,митохоцдрцьь подвергают лополццтельной очистке, Для этого цх суспенлцруют в среде выделения цаслаивают ца 7%-цый раствор фиколла, приготозленного на среде выделения, а затем центрифугируют прп 15000 о в течение 10 мин. Все операции по выделению и очистке митохондрий проводят прц 0 - 2 С. Из конечных суспензий митохондрий отбирают алцкзоты для определения количества белка ц РНК, определения дыхательной активности митохондрий и активности маркерных ферментов микросом и лизосом.Для выделения РНК митохондрии суспендируют з 0,01 моля калийацетатноьм буфере, рН 5,1, содержащем 1% лолецилсульфата натрия и смесь 0,5 ополивинилсульфата и 0,5% макалоила. К полученной вязкой суопензьььь добавляют равный объем смеси фенол-хлороформ (1: 1 по ооъему)535959 Формула изобретения Составитель С. Малютина Техред А, Камышннкова Корректор И. Снмкина Редактор А. Бер Заказ 1149/1738 Изд. М 329 Тираж 630 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Тнп. Харьк, фил. пред. Патент н встряхива 1 от на качалке прц 2 С в течение 10 мин, Фазы разделяют центрифугцро-а:шем при 5000 об/мссн в течение 20 мин. Нижний органический слой удаляют шприцем, и промежуточный и водный слои повторно экстра гируют смесью фенол-хлороформ, После улаления органического слоя промежуточный и водный слои экстра гируют последовательно 4 раза хлороформом, встряхивая смесь прп 2 С в течение 5 мин. Фазы разделяют цец трифугированием цри 5000 дбмин в течение 15 лин. В процессе очистки промежуточный слой полностью исчезает, РНК из водцога слоя осаждают 2 об. холодного этанола, содержащего 0,1 моля хлористый натрий, Оса док РНК растворяют в 0,01 моля калий-ацетатном буфере, рН 5,1, определяют количество и фракционируют в 5 - 20%-ном линейном градиенте сахарозы, приготовленном на 0,01 моля калий-ацетатном буфере, рН 5,1, содержащем по 1,00 мкг/л полцвпнилсульфата и макалоида, 0,1 моля хлористого натрия и 0,05% додецилсульфата натрия.,При выделении РНК этим способом; е наблюдается признакоз деградации митохондрцальной РНК.П р и.м е р 2. Печень крысы извлекают и гомогенизируют в 0,05 моля трис-НС буфере, рН 7,4, содержащем 0,25 моля сахарозы, 10 лгмоль хлористого магния и природный 30 ингибитор рибонуклеаз. Природный ингибитор рибонуклеаз выделяют из печени крысы. Для этого 1 печень гомогецизируют в 1 О м.полях трис-НС 1 буфере, рН 7,4, содержащем 0,3 моля сахарозы, 2,5 ммоля хлористого ка лия и 25 ммоля хлористого магния. На 1 г веса печени берут 4 мл среды выделения, Полученный гомогенат центрифугируют при 12000 д в течение 10 мин. Надосадочную жидкость центрифугируют при Зб 0000 д 2 час. 40 Полученный супернатант является ингибитором рибонуклеаз, При выделении митохондрий его добавляют в среду выделения в соотношении 1: 1. 45 При выделении митохондрий го;1 огенат центрифугируют при 1000 д в течение 10 мин для удаления примесей целых клеток и ядер. Из полученной надосадочной жидкости мито хондрии осаждают при 11000 д в течение 10 мин. Трижды проводят дополнительное переосаждение митохондрий в тех же условия:.:, Выделе;шые митохондрии подвергают дополнительной очистке путем обработки дцгцто.-шно.,:, Для этого к мцтохондрцям, суспендированцым в минимальном объеме (около 100 мг мцтохондрцального белка/лл), добавляют раствор дигитонина до конечной концентрации 1,5 лг/100 мг белка митохондрий. Раствор дигитонина готовят непоаредственно перед опытом на среде выделения в концентрации 15 лг/мл. Митохондрии выдерживают с дигитонином 15 лшн при 0 С и, разбавив средой выделения, осаждают при 8000 д в течение 10 мин. Операции по выделению митохондриальной РНК те же, что в примере 1. Способ выделения рибонуклеиновой,кислоты из митохондрий, заключающийся в гомогенизации тканей, центрифугировании, осаждении митохондрий из надосадочной жидкости, повторном центрифугцрованиц для очистки от примесей и ресуспендированпн в депротеици. зируюгцих смесях, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью выделения недеградпрованной рибонуклеиновой кислоты, гомогенизацию тканей проводят в буферном растворе, содеожащем 1 - 10 ммолей хлористого магния и ингибиторы рибонуклеаз, например, смесь 0,01 - 0,1% поливинилсульфата ц 0.01 - 0,1% макалоида, проводят очистку в тех же растворах, дополнительную очистку и выделение рибонуклеиновой кислоты прп 0 - 2 С и для депротеинизациц используют смесь фенол-хлороформ (1: по объему).2, Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что дополнительную очистку проводят путем центрифугирования через 5 - 10% -ный расТвор фиколла.3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительную очистку проводят путем обработки 0,1 - 0,2%-ным дигитонином,Источник информациипринятый во внимание при экспертизе:1. Молекулярная биология, 1969,3, с. 315 - 321 (прототип).