Штамм бактерий bacillus liснеni fоrмis продуцент рестриктазы в 13i

%19довательскийеский институтществИ.Речкунова и онструк- биологи.Х,ДегтяГОСУДАРСТВЕННЫ И КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ АВТОРСКОМУ СВИДЕТ(56) ВоЬегтз В,.1.тпе 1 г 1 зозЫзогпегз16, 271 - 313,Кта К., НготоКЯОЬадазЫ А, Аепбопос 1 еазесесовсемсиз - йи24, р, 8685-8694,Везтг 1 ст 1 оп епзуаез апб Мос 1 ес Ас 1 бз Вез, 1988,а М., ОзЫаа А., КабопзЫ сс. 111, а пев.гезтгстоп, агав Ас 1 петоЬастег с 1 е 1 с Асбз Вез, 1985, 13,Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой штамм, который можно использовать для получения эндонуклеаэы рестрикции (рестриктазы), узнающей последовательность нуклеотидов 5 - ТССАв составе двухцепочечной ДНК и расщепляющей ДНК в этой области.Цель изобретения - выявление штамма ВасН 1 цз НсЬепНоггп 1 з ВКПМ В(В 13), продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с более высоким выходом,Штамм бактерий ВасН 1 цз НсйепОогв 1 з Ввыделен в результате поиска продуцентов оестриктаз среди микробов воздуха вне помещения.(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВАС 11 ОЯ 1 СНЕИ 1 ЕОВМ 1 Я - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ 81131(57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, Цель изобретения - выявление штамма ВасН 10 з НсЬепЮопп 1 з ВКПМ В(В), продуцирующего рестриктазу с более высоким выходом фермента, Штамм продуцирует эндонуклеазу рестрикции ВН 13 1, которая является изошизомером рестриктазы Язр, МН ВН 13 1, узнает последовательность 5-ТСС 66 А - 3 в составе двухцепочечной ДНК. Биомассу штамма выращивают в питательном бульоне на основе гидролизата кильки до поздней логарифмической фазы, Клетки разрушают ультразвуком и рестриктазу получают хроматографической очисткой на биогеле А 05 М, ДЕАЕ-целлюлозе и фосфоцеллюлозе, Выход фермента 5000 ед, на 1 г биомассы, Препарат пригоден для генно-инженерных работ, 1 табл. Штамм бактерий ВасН 1 оз НСЬеп 0 оге 1 з имеет следующие характеристики.Морфологические признаки. В молодой культуре (16 - 18 ч) клетки подвижные, палочковидные, небольшие 0,5-0,7 мкм в поперечнике и 2 - 4 мкм в длину, Располагаются поодиночке, парами, Споры эллиптические 0,6 х 1 мкм. Отчетливой раздутости спорангия нет. Грамположительные.Физиолого-биохимические признаки. Факультативный анаэроб, каталазоположительный. Аэробно слабо образует кислоту иэ глюкозы, сахарозы, мальтозы, глицерина, маннита, но не иэ арабинозы, сорбита, рамнозы, лактоэы, этанола. Из глюкозы также образует ацетоин, но не газ. Анаэробно иэ1650697 Параметры Показатели ля штамма А. сасоасетсм В.сЬепИоппз В 13Число рестриктаз, среди которых надо выделить специфичную К 5 - ТСС 66 АЧисло хроматографий привыделении рестриктазы Выход очищенного фермента, е ./г биомассы1000 5000 Составитель И,ПриваловаТехред М.Моргентал Корректор М,Демчик Редактор Н,Гунько Заказ 1583 Тираж 374 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж. Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 101 глюкозы образуют кислоту, Гидролиэует крахмал, казеин, желатин, твин, Дезаминирует аргинин. Сероводород и индол не образует. Восстанавливает нитрат в нитрит, Чувствителен к ампилициллину, хрорамфениколу, канамицину, стрептомицину, тетрациклину (100 мкг/мл среды 1), Используют глюкозу в качестве единственного источника углерода и энергии для роста, Растет при 10 - 55 С, оптимум 37 С, рН среды 6 - 8, оптимум рН 7,0, концентрация йаС 0 - 7 о , оптимум 0,7 о , Содержание Г+ Ц в ДНК 49% (по плавучей плотности).Культуральные признаки. Среда 1, питательный агар, г/д: панкреатический гидролизат кильки 17,9; йаС 5,9; агар 11,2, рН 7,3.ф. 0,1. После 17 ч инкубирования при 37 С образует плоские неправильной формы шероховатые, морщинистые, серые колонии диаметром 1 см и более, часто заполняющие всю поверхность агара, Выращивание при 20 С позволяет получить отдельные колонии, которые первоначально круглые, выпуклые, гладкие, блестящие, прозрачные, затем становятся шероховатыми, серыми, неправильной формы,Среда 2, питательный бульон, г/л; гидролиэат кильки 33; йаС 7, рН 7,2 - 7,4,При выращивании с интенсивной аэрацией при 37 С штамм дает равномерное помутнение, Среду используют для препаративного выращивания биомассы.Среда 3, твердая минимальная, г/л: глюкоза 3; чН 4 чОз 0,3; КН 2 РО 40,1; КгНР 04 0,1; М 9 ЯОа 0,05; Ма С 0,05; СаСОз 0,5; Ге 304 0,0005; агар 15; водопроводная вода. После 50 ч инкубации при 30 С дает плоские колонии неправильной формы, Среду используют для выявления минимальных пищевых потребностей штамма,П р и м е р 1. Выращивание биомассы и выделение рестриктазы В 13 ,Культуру выращивают на среде 2 при37 С, аэрации 1,5 л/л мин, скорости вращения мешалки 200 об/мин. Когда оптическаяплотность культуры достигает 4,5 см при5 550 нм, клетки осаждают центрифугированием и хранят при - 20 С. Выход биомассы7,0 г/л,Рестриктазу выделяют по известнойсхеме, включающей разрушение клеток уль 10 траэвуком, гель-фильтрацию на биогеле А0,5 М, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозеи фосфоцеллюлозе. Фермент хранят при -20 С в буфере с 50 о -ным глицерином.Параметры получения рестриктаз из15 Васцз сЬепПогтз В 13 и АспетоЬастегсасоасеОсцз приведены в таблице.П р и м е р 2. Определение активностирестриктазы В 13 1,Реакционная смесь в 20 мкл содержит20 0,5 мкг ДНК фага, 10,05 М трис-НС (рН 8), 0,2М МаС, 0,01 М М 9 С 2, Для определения активности аликвоты фермента 1 - 10 мкл вносят в реакционную смесь, инкубируют при55 С в течение 1 ч, затем проводят электро 25 фореэ в 1 -ном агарозном геле. За единицуактивности фермента принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНКфага А в условиях реакции.30 Таким образом, предлагаемый штамм,по сравнению с известными, обеспечиваетповышенный (в 5 раз) выход целевого фермента; продуцирует только одну рестриктазу и позволяет сократить технологически35 трудоемкие хроматографические стадииочистки (с 5 стадий в известном способе до3 в предлагаемом). Формула изобретения40 Штамм бактерий Васцз сЬепИоппзВКПМ В- продуцент рестриктазыВ 13 .