Фаговый вектор к9 для конструирования геномных библиотек

(5)5 С 12 Й 15 ГОСУДАРСТВЕ ННЫ И КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ(53) 575 224 2 577 2(048 Х 088 8) (56) Нап Е.Нйипег чЧ,Е. Ивс, А 1987, ч, 15, р. 6304.Нап Е.Н., Ятгатоаа С., йц ВосЬеазоу, 1987, ч. 26, р. 1617- (54) ФАГОВЫЙ ВЕКТОР ЯЯК 9 ДЛ РУИРОВАНИЯ ГЕНОМНЫХ БИБ Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии.Целью изобретения является упрощение способа конструирования геномных библиотек при использовании вектораЯЯК 9,Вектор ЯЯК 9 получен на основе ВСЕМВ.3 и фазмиды ЯК 2 Мй, Он характеризуется следующими признаками: размерт,п.н., емкость встраиваемой ДНК 4,5 - 19,0 т.п,н. Состоит из ВСЕМВ 3, соединенного с фазмидой ЯК 2 ЬЯй, Фазмида ЯК 2 Мй представляет собой фазмиду ЯК 2 А, в которой удалены Яа и Есой участки. Спектр хозяев для ЯЯК 9: .Е 392 = Е Изб й 514 (гк, ак), зар Е 44, зор Е 58,ас У 1/02 (асЕУ)6, да К 2, да Т 22, ает В 1, тгр й 55;М 109 = гес А 1, Ьас рго, епб А 1, дугА 96. Э, Ьзб й 17, зир Е 44, ге А 1, Е; тга 036, рго АВ, ас ц 2 ЬМ 15, 0359= Изб йк 1 тзб Мк, зир Еф 80, р 2,Полученный вектор позволяет получать репрезентативные геномные библиотеки с(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, Целью изобретения является упрощение способа конструирования геномных библиотек при использовании вектора ЯЯК 9, Вектор АЯК 9 получен на основе фага ВСЕМВ 3 и фазмиды. Он позволяет получать репрезентативные геномные библиотеки с использованием рестриктаз ВааН, ЯацЗА, МВО и других, имеющих такие же липкие концы. АЯК 9 дает возможность перевода вставки в плазмидную и одноцепочечную форму, а также используя коммерческие препараты праймеров, специфически метить 5 и 3-концы вставки, что удОбно для целей "и рогулки" по хромосоме. использованием рестриктаз Ваа 1, Яао ЗА, МЬО и других, имеющих такие же липкие концы, ЯЯК 9 дает возможность перевода вставки в плазмидную и одноцепочечную формы, при этом используется способ, принципиально отличный от запатентован- О ного фирмой "Ятгатадепе". ИПрименение этого метода позволяет С быстро, эффективно и стабильно осущест)ь вить перевод вставки в плазмидную форму. со Для библиотек вАЯК 9 гарантированы невоз- (р можность суперинфекции фагом М 13 и неконтролируемый перевод вставки ДНК в фаге 1 в одноцепочечную форму. ЯЯК 9 дает возможность, используя коммерческие препараты праймеров, специфически метить 5- и 3-концы вставки, что удобно для целей "прогулки по хромосоме".Таким образом, применение АЯК 9 для конструирования геномных библиотек дает значительный выигрыш во времени.П р и м е р 1, Способ заключается во введении в фаг ВСЕМВ 3 фаэмиды ЯК 2 МВ.Стадия 1, ДНКфазмиды ЯК 2 А, гидролиэуют рестриктазой ЯаП и останавлйвают реакцию прогреванием 15 мин при 65 С, С помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 из Е,соП в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов "затупляют" липкие концы, Затем раствор ДНК разводят в три раза и проводят самолигирование, Лигированную ДНК вводят в клетки Е,соП штамм 1.М,109, Рассев бактерий производят на чашки Петри с 2-ным 1:агаром, содержащим 25 мкг/мл ампициллина, 0,1 1 РТ 6 и 0,1% Х-да 1, Из десяти белых колоний по стандартным методикам выделяют ДНК и анализируют рестриктазами ЕсоВ 1, Вав 1, ЯаЙ. Фазмиду, содержащую ЕсоВ 1, Вав 1, но не содержащую ЯаП-участков узнавания рестриктазами и названную ЯК 2 ЬЯ, используют на следующей стадии.Стадия 2, Удаление участка узнавания рестриктазы ЕсоВ 1 в фазмиде ЯК 2 М. ДНК фазмиды ЯК 2 М гидролизуют рестриктазой ЕсоВ и останавливают реакцию прогреванием 15 мин при 65 С. С помощью фрагмента Кленова в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов затупляют липкие концы. Затем ДНК разводят в три раза и проводят самолигирование, Лигированную ДНК расщепляют рестриктазой ЕсоВ и вводят в клетки Е,со 1 штамм .1,М,109. Рассев бактерий производят на 1: агар с 25 мкгlмл ампициллином, Из десяти колоний по стандартным методикам выделяют ДНК и анализируют рестриктазами ЕсоВ 1, Вав 1 и ЯаП. Фазмиду, содержащую Вав 1, но не содержащую ЕсоВ и ЯаЙ участков (названа ЯК 2 МВ), используют на следующей стадии.Стадия 3, Конструирование рекомбинантной фазмиды дЯВ. ДНК фага Ад П гидролизуют рестриктазой Вав 1 и фермент инактивируют прогреванием, Затем проводят отжиг липких концов фага А инкубацией раствора ДНК при 42 С в течение 1 ч, и центральный Вав - фрагмент размером около 6,5 тыс. пар нукл. очищают гель-электрофорезом в 0,7-ной легкоплавкой агароэе (препарат А), ДНК фазмиды ЯК 2 МВ гридролиэуют рестриктазой Вав и после инактивации фермента прогреванием лигируют с препаратом А. Лигированную ДНК вводят в клетки Е,соП штамм 1,М. 109 и рассееают на 1-агар с ампициллином (25 мкг/мл). С выросших колоний снимают отпечатки на нитроцеллюлоэные фильтры и проводят гибридизацию с препаратом А, ДНК которого метят Р с помощью никтрансляции. Клетки иэ пяти колоний, гибридиэующихся с препаратом А, наращивают в10 мл 1:среды с ампициллином (100 мкг/мл)и выделяют плазмидную ДНК стандартным5 методом. Анализ полученной ДНК рестриктазами ЕсоВ 1, Вав 1, ЯаП подтверждает клонирование в фазмиде ЯК 2 МВ участка Лдс 1,Эту фазмиду, названную дЯВ, используют еследующей стадии.10 Стадия 4. Конструирование фага-вектора ЯдЕв 7. ДНК фазмиды дЯВ гидролизуютрестриктазой ВдП и фермент инактивируютпрогреванием. ДНК фага ЛЕМВ 1.3 гидролизуют рестриктаэой Вав 1 и фермент15 инактивируют. Оба препарата ДНК в эквимоля рных соотношениях смешивают и лигируют, Лигированную ДНК упаковывают вбелки фага А 1 п и 1 го и полученные фаговыечастицы рассевают на газон клеток Е,соП20 штамм 1 Е 392, содержащий 0,1% Х-да. Иэдесяти голубых бляшек наращивают фаг,выделяют ДНК и анализируют с помощьюрестриктаз ЕсоВ 1, Вав 1, ЯаП. Один из фагов,названный А д ЕЯ 7, имеет ожидаемую струк 25 туру, Его используют на следующей стадии.Стадия 5, Конструирование фага-вектора ЛЯК 9. ДНК фага ЕМВ 1.3 гидролизуют рестриктазой Вав и вставочный фрагментразмером около 13,7 тыс,пар нуклеотидов30 очищают гель-злектрофорезом в 0,7 о -нойлегкоплавкой агарозе (препарат А), ДН К фага ЛдЕЯ 7 гидролизуют рестриктазой Вав и"плечи" очищают гель-электрофореэом влегкоплавкой агарозе (препарат Б). Препа 35 раты А и Б в эквимолярных соотношенияхсмешивают и лигируют. Лигированную ДН Купаковывают в белки фага А 1 п и 1 тго и полученные фаговые частицы рассевают на газон клеток Е.соП; штаммЕ 392. Из шести40 бляшек наращивают фаг, выделяют ДНК ианализируют с помощью рестриктаз ЕсоВ 1,Вав 1 и Яаб. Один из фагов, названный ЯЯК 9,имеет ожидаемую структуру и используетсядля конструирования репрезентативных ге 45 номных библиотек,Применение МЯК 9. Фаг ЯЯК 9 удобен дляполучения репрезентативных геномныхбиблиотек по "классической" методике.ДНК фага МЯК 9 гидролизуют 10-кратными избытками рестриктаэ ЕсоВ и Вав. Затем ДН К осаждают изопропанолом, причемзначительная часть олигонуклеотидныхфрагментов ЕсоВ 1 - Вав 1 остается в супернатанте и после растворения осадка ДНКполучают концевые фрагменты (" плечи"МЯК 9 с липкими концами Вав 1 и внутреннийфрагмент с липкими концами ЕсоВ.Геномную ДНК не полностью гидролизуют рестриктазой вам ЗА 1 (или МВО 1) ивыделяют фрагменты размером 15-20 т.п.н. (с помощью гель-электрофореза или центрифугирования). Эти фрагменты лигируют с фаговой ДНК, обработанной, как описано выше, лигированную ДНК упаковывают в белки фага А 1 п ч 1 сго и образовавшимися фаговыми частицами заражают клетки Е.соИ. При этом обычно около 70 выросших фагов - рекомбинанты,Следует отметить, что в МЯК 9 сохранена селекция в пользу рекомбинантных фагов и исходные, не рекомбинантные ЯЯК 9 не способны размножаться на клетках Е.соИ, лизогенных по фагу Р 2 (эр 1-фенотип) - штаммы 0 359, йМ 539.Вставка ДНК в АЯК 9 может быть легко переведена в плазмидную форму, При этом используют другой принцип, чем в Ж.АР. ДНК рекомбинанта ЯК 9 гидролизуют рестриктазой ЯаИ (можно применять также Са) и инактивируют фермент 3-кратным замораживанием/оттаиванием. Обе рестриктазы достаточно редко расщепляют эукариотическую ДНК (Яа имеет в среднем один участок узнавания на примерно 50 тыс, пар нуклеотидов, а Оа - около 20 тыс, пар нуклеотидов). Затем ДНК разбавляют и самолигируют. Лигированную ДНК вводят в компетентные клетки Е,соИ, которые высевают на 1:агар с ампициллином. Выросшие колонии содержат вставку ДНК в плазмидной форме, причем плазмида либо вовсе не содержит нуклеотидных последовательностей фага А (в случае ЯаИ), либо небольшую их часть (в случае Са). Процесс перевода в плазмидную форму быстр (3 - 4 ч) и эффективен (0,1 мкг/мл ДНК рекомбинанта дает много сотен колоний), Так же как для ЯЯК 12, для ЯЯК 9 и его рекомбинантов существует и другой путь перевода в плазмидную форму - путь прямой инфекции фагом клеток Е,соИ, резистентных к литическому размножению фага А, однако этот путь менее удобен и может быть полезен только для специальных опытов.При суперинфекции клеток Е.соИ, содержащих плазмиду, фагом М 13 ДНК плазмиды упаковываются в белки фага в одноцепочечной форме, удобной для секвенирования ДНК вставки по известному методу Сэнгера,Емкость ЛЯК 9 до 19 тыс. пар нуклеотидов, что вполне достаточно для получения репрезентативных геномных библиотек, поскольку при расчетах репрезентативности. библиотеки обычно исходят иэ средней вставки в 15 тыс. нуклеотидов.Таким образом, фагАЯК 9 можно использовать для конструирования репрезента тивных геномных библиотек по "классиче-. скому" методу, Основные преимущества предлагаемого вектора по сравнению с известным заключается в возможности получения библиотеки генов беэ предварительной очистки "плечей" фага , отбора против нерекомбинантных фагов, быстрого, эффективного и контролируемого перевода в плазмидную форму, свободную от "плечей" фага Я, а также возможности перевода в одноцепочечную форму для определения первичной структуры ДН К по методу Сэнгера, в гарантированности от воэможности суперинфекции библиотеки в ЯЯК 9 фагом М 13, возможности специфического мечения 5-, 3- и других участков вставки с использованием стандартных, доступных препаратов эатоавок. 5 10 15 20 П р и м е р 2, Клонирование в АЯК 9фрагментов геномной ДН К человека. 3 мкг ДНК человека расщепляют рестриктазой Вав 1 в стандартных условиях и 25 инактивируют фермент прогреванием 15мин при 65 С. 3 мкг ДНК ЯК 9 гидролизуют рестриктаэами Ваа и Есо Ии инактивируют ферменты прогреванием, Оба препарата смешивают(весовое соотношение ДНК век тора и геномной ДНК 1:1) и проводят лигирование при сумманой концентрации ДНК -250 мкг/мл.1 10 мкг лигированной ДНК упаковывают в белки фага А 1 и ч 11 го и 1/500 полученных фаговых частиц рассевают на 35 газон Е,са 1, штамм С 359. Иэ шести случайно отобранных бляшек в 10 мл 1:среды с 1 ЕЧ 92 выращивают фаги и выделяют из них ДН К. Электрофоретический анализ ДНК показывает, что все они рекомбинанты и со держат вставку ДНК 10 - 15 тыс. парнуклеотидов, 0,5 мкг ДНК одного из них(В 1) гидролиэуют в течение 30 мин 1 ед. рестриктазы ЯаИ, Фермент инактивируют 3-кратным замораживанием/оттаиванием. ДНК 45 разводят и лигируют при комнатной температуре в течение 1 ч 0,1 мкг лигированной ДНК добавляют к компентентным клеткам Е.соИ штамм .М. 109, инкубируют 10 мин при 0 С, а затем 5 мин при 38 С и после 50 добавления 1 мл-среды еще 45 мин при37 С. Затем 0,2 мл клеток рассевают на 1:агар с ампициллином (25 мкг/мл). Из трех колоний в 10 мл-среды с ампициллином (25 мкг/мл). Из трех колоний в 10 мл 1.-среды 55 с ампициллином (50 мкг/мл) наращиваютклетки и выделяют ДНК щелочным лизисом.Электрофоретический анализ ДНК показывает, что плазмиды содержат ту же вставку ДНК, что и исходный фаг М 1.Заказ 1583 Тираж 385 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб,. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Формула изобретения Фаговый вектор ЯЗК 9 для конструирования геномных библиотек размером 47,7 т.п,н., содержащий Соз - ЗаП - фрагмент ДНК фага ВСЕМВ.3 - левое плечо размером 20,3 т.п.нЗа - В 9 П - фрагмент ДНК фазмиды ЗК 2 А размером 3,8 т,п.н., в котором методом достройки уничтожен осой-участок; Вав - Ваа фрагмент ДНК фага ВСЕМВ .3 размером 13,7 т,п.н.; Ваа - Вае - фрагмент ДНК фазмиды ЗК 2 А размером 0,7 т.п.н., в котором методом достройки уничтожен ЗаП-участок; ЗаП - Соз - фрагмент ДНК фагаАЕМВ.3 - правое плечо, размером 9,2 т.п.н.; места возможной вставки чужеродной ДНК по участкам узнавания 5 рестриктаз Вагп и Есой; емкость вектора4,4 - 19,0 т,п,н.; спектр хозяйств: штаммы ЕзсйегсЫа соП: .Е 392 = Р Изб й 514(а, па), зцр 44, зцр Р 58, ас У 102. (ас ЕУ)6, даК 2, 9 а Т 22, вет В 1, игр й 55; М 109 - гес А 1, 10 Жас рго, епб А 1,9 угА 96, й, Изб й 17, зцрЕ 44, ге А 1, Р; 0359 = Ьзбй, ЬзбМ, зцрР, ф 80, Р 2.